【摘要】：骨缺損的修復(fù)是骨修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所面臨的難題,而骨組織工程發(fā)展為骨缺損的修復(fù)提供了新的研究方向。醫(yī)用鈦金屬材料具有良好的機(jī)械性能和生物相容性,因此,以其作為骨組織工程支架材料的相關(guān)研究得到廣泛的報(bào)道。但是,鈦金屬材料表面不具有生物學(xué)活性,容易導(dǎo)致受體骨組織從植入的鈦金屬材料表面脫落。所以,探索如何提高鈦金屬材料表面的生物學(xué)活性成為該領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是骨形成和發(fā)生過(guò)程中重要的調(diào)控因子,并且能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細(xì)胞方向分化,進(jìn)而被廣泛的用于提高骨組織工程支架材料表面的生物學(xué)活性。有研究發(fā)現(xiàn),3,4-L-二羥基苯丙氨酸(3,4-L-dihydroxyphenylalanine,DOPA)能夠粘附在Au、Ag、Ti O2等多種金屬材料表面。因此,以DOPA作為媒介,將BMP-2固定到鈦金屬材料表面,對(duì)于提高鈦金屬材料表面的生物學(xué)活性具有重要意義。本課題通過(guò)基因工程的方法將酪氨酸重復(fù)序列(Tyrosine-lysine-tyrosinelysine-tyrosine,YKYKY)整合到BMP-2的基因序列末端,并利用大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)將其進(jìn)行表達(dá);利用快速蛋白液相色譜(Fast protein liquid chromatography,FPLC)將大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,然后,通過(guò)酪氨酸羥化反應(yīng)完成DOPA的轉(zhuǎn)化;通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和免疫印跡等方法對(duì)蛋白質(zhì)的大小、純度和特異性進(jìn)行鑒定;利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)確定YKYKY中的酪氨酸是否被氧化轉(zhuǎn)變?yōu)镈OPA;通過(guò)圓二色光譜法(Circular dichroism spectrum,CDS)和ELISA法對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性進(jìn)行分析和檢測(cè);通過(guò)掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)、能譜儀(Energy dispersive spectrometer,EDS)和耗散型石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)對(duì)固化后材料的表面、碳元素特征峰和生長(zhǎng)因子含量的改變進(jìn)行分析;利用小鼠成肌細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與固化的鈦金屬材料共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),測(cè)定經(jīng)過(guò)固化后鈦金屬材料成骨誘導(dǎo)能力的改變;最后,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定固化的鈦金屬材料表面鈣元素的累積情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:所構(gòu)建的BMP-2-YKYKY質(zhì)粒能夠在E.coli中表達(dá),且所獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)純化后具有較高純度,進(jìn)一步通過(guò)分子量和特異性的鑒定,確定所獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)為BMP-2-YKYKY;經(jīng)過(guò)羥化反應(yīng)后,BMP-2-YKYKY中的3個(gè)酪氨酸均被羥化成為DOPA,同時(shí),羥化后的蛋白質(zhì)溶液仍然具有較高的純度;通過(guò)生物學(xué)活性鑒定,發(fā)現(xiàn)YKYKY和DOPA的加入并沒(méi)有對(duì)BMP-2的生物活性功能區(qū)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響;并且,經(jīng)過(guò)修飾的BMP-2不僅生物學(xué)活性幾乎沒(méi)有變化,而且具備了DOPA的粘附能力(在p H=8.5時(shí),粘附能力最強(qiáng));BMP-2-XKXKX能夠顯著改變鈦金屬材料表面的粗糙程度,提高BMP-2在鈦金屬材料表面的粘附量(表面的生長(zhǎng)因子含量達(dá)到631.43ng/cm2);經(jīng)過(guò)BMP-2-XKXKX修飾后的鈦金屬材料具有較強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)能力,不僅能夠顯著促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12-BRE-Luc)內(nèi)雙熒光素酶(DualLuciferase)的表達(dá),而且可以顯著促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和成骨相關(guān)基因RUNX2、OSTERIX和ALP的表達(dá),抑制干性基因OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá);進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)過(guò)BMP-2-XKXKX固化的鈦金屬材料能夠促進(jìn)鈣元素在材料表面積累。綜上所述,本課題以DOPA作為媒介,將BMP-2固定到鈦金屬材料表面,探索固化后鈦金屬材料表面的生物學(xué)活性改變。結(jié)果提示,DOPA的引入不僅能夠保持BMP-2的生物學(xué)活性,而且可以促進(jìn)BMP-2在鈦金屬表面的粘附,提高鈦金屬材料表面的生物學(xué)活性,增強(qiáng)鈦金屬材料的成骨誘導(dǎo)能力,為鈦金屬材料的臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 骨重塑模擬圖引自：http://www.sierrasil.com/connect/news/studies/the-role-of-minerals-in-joint-health/雖然骨表現(xiàn)出的性質(zhì)是固體和剛性,但它實(shí)際上是一個(gè)新陳代謝活躍的組織。在成年人的骨骼,骨重塑的過(guò)程包括大多數(shù)骨代謝活動(dòng)發(fā)生,這對(duì)維持骨骼結(jié)構(gòu)和鈣穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。圖 1.1 說(shuō)明了骨重塑的過(guò)程，骨重塑一般有三個(gè)時(shí)期，即骨吸收期、骨逆轉(zhuǎn)期和骨形成期。涉及到破骨細(xì)胞的脫骨化和脫鈣化,其次未礦化的成骨細(xì)胞的形成,最終變成了礦化。骨重塑周期由三個(gè)階段組成: ①骨吸收期,此時(shí)破骨細(xì)胞消化表面殘留的老化骨；②骨逆轉(zhuǎn)期,這時(shí)單個(gè)核細(xì)胞出現(xiàn)在骨表面；③骨形成期,成骨細(xì)胞形成與礦質(zhì)化�？梢园l(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞是骨組織工程最為關(guān)鍵的細(xì)胞，成骨細(xì)胞在骨基質(zhì)礦質(zhì)化過(guò)程中逐漸被包被在骨陷窩中，從而成為骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞作為重要的種子細(xì)胞，主要來(lái)源有骨膜、骨髓和骨外組織[5]。

圖 1.2 組織工程應(yīng)用的干細(xì)胞及其分化圖ESC: Embryonic stem cell，胚胎干細(xì)胞; NSC: Neuronal stem cell，神經(jīng)干細(xì)胞;EpSC: Epidermal stem cell，表皮干細(xì)胞; MSC: Mesenchymal stem cell，，間充質(zhì)干細(xì)胞; HSC: Haematopoeitic stem cell，造血干細(xì)胞。引自：http://www.york.ac.uk/res/bonefromblood/background/MSC%20diff%20best.jpg在適宜的誘導(dǎo)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠較為容易地分化為軟骨、成骨、成肌、基質(zhì)和脂肪細(xì)胞等不同種類的細(xì)胞（圖 1.3）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其分離較容易且不涉及倫理和來(lái)源問(wèn)題逐漸成為骨組織工程中使用最廣泛的種子細(xì)胞之一。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R68

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李娟;戴文達(dá);董健;;骨組織工程研究進(jìn)展[J];中國(guó)骨傷;2008年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 陶鳳娟;純鈦表面塑性變形納米化對(duì)MC3T3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

2 何嬋;Ti-N/Ti-O復(fù)合薄膜人工心臟瓣膜表面改性[D];西南交通大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2587075