【摘要】：研究背景和目的： 軟組織生物材料填充是整形外科臨床治療的主要手段之一，它主要應(yīng)用于先天性或后天性各種原因所造成的體表組織器官畸形或缺損的矯正與修復(fù)。目前，臨床常見的軟組織填充材料主要有硅橡膠（silicone rubber，SR）、羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、膨體聚四氟乙烯（expended polytetrafluoroethylene，ePTFE）、高密度聚乙烯（high Density Polyethylene，HDPE）等。其中，SR具有良好的柔韌性和力學(xué)性能，穩(wěn)定的理化性能，還有無毒、無味、不致癌等特性，可以長期植入體內(nèi)而不被體液腐蝕。但SR表面呈強(qiáng)烈的疏水性，生物相容性較差，使組織細(xì)胞無法粘附生長而在其表面形成包膜，在時(shí)間和外界刺激的影響下，可能發(fā)生攣縮，致使植入體硬化、變形，甚至排出體外、造成感染等。HA則具有良好的生物活性和組織相容性，在植入人體后，能夠迅速與周圍組織細(xì)胞相結(jié)合，，可以避免排異反應(yīng)的發(fā)生。但是HA的脆性大、力學(xué)性能差、加工和塑形都比較困難，所以常被填充在受力較低的部位或加工成顆粒用于制作涂層材料或復(fù)合材料，應(yīng)用范圍受限。其余材料均各有利弊，因此，對(duì)新型材料的研發(fā)和現(xiàn)有材料的改性一直是整形外科的研究熱點(diǎn)，并且任何一種新型材料的推廣都必將大幅度提升整個(gè)醫(yī)療行業(yè)的技術(shù)水平。 在整形外科手術(shù)中，存在一些不需要對(duì)材料進(jìn)行雕刻的情況，或只須按照組織缺損范圍對(duì)材料進(jìn)行邊緣修剪即可�；谏鲜鲂枨螅覀�?cè)谡n題研究中，將HA顆粒通過涂層的方法涂覆于SR表面，制備出新型涂層材料，使其既保留了SR良好的生理惰性和穩(wěn)定的理化性能，且擁有HA極佳的細(xì)胞粘附能力和良好的生物相容性。同時(shí)，參照國家生物醫(yī)用材料標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)涂層材料進(jìn)行力學(xué)性能、表面理化性能和體外細(xì)胞生物學(xué)相容性等方面的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。 研究方法：本研究分為三部分： 第一部分：制備涂層材料并進(jìn)行形貌觀察 根據(jù)雙組份液態(tài)硅橡膠室溫固化的時(shí)間，將兩種粒徑的羥基磷灰石顆粒HA-1（粒徑40μm）和HA-2（粒徑150μm）分別噴涂于硅橡膠表面，制備出涂層材料HA-1/SR和HA-2/SR，并使用掃描電鏡對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。 第二部分：材料的理化性能及力學(xué)性能檢測(cè) 使用傅立葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）檢測(cè)純SR、HA-1/SR、HA-2/SR表面的理化性能；根據(jù)醫(yī)用硅橡膠的國家標(biāo)準(zhǔn)要求，用邵氏硬度計(jì)和電子萬能試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)各組材料的力學(xué)性能，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 第三部分：材料的體外生物學(xué)功能檢測(cè) 1.應(yīng)用體外培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維3T3細(xì)胞和原代人真皮成纖維細(xì)胞； 2.實(shí)驗(yàn)分組： 1）正常組：未經(jīng)修飾的培養(yǎng)瓶中生長的細(xì)胞； 2）凋亡組：培養(yǎng)瓶中甲醛固定的細(xì)胞； 3）純SR組：純SR材料表面生長的細(xì)胞； 4）HA-1/SR組：HA-1/SR材料表面生長的細(xì)胞； 5）HA-2/SR組：HA-2/SR材料表面生長的細(xì)胞。 3.將人真皮成纖維細(xì)胞接種于各組材料表面培養(yǎng)48h，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)及粘附情況；采用CCK-8計(jì)數(shù)法檢測(cè)成纖維細(xì)胞在各組材料表面的增殖情況及細(xì)胞毒性；Hoechst33342和PI雙染法分析材料表面細(xì)胞的凋亡及壞死情況； 4.分別運(yùn)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)材料表面生長的3T3細(xì)胞中影響細(xì)胞粘附功能的紐蛋白（vinculin）和骨橋蛋白（OPN）的mRNA及蛋白表達(dá)。 研究結(jié)果 1.利用SR的固化規(guī)律，成功制備了HA/SR涂層材料。使用掃描電鏡觀察HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料中HA顆粒較均勻的分布在SR表面。 2. FTIR、XPS分析顯示，HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料中HA與SR本身化學(xué)鍵合未被破壞。同時(shí)，在體外力學(xué)測(cè)試中，純SR組、HA-1/SR組和HA-2/SR組的邵氏硬度分別為31±2.05度、28.14±1.83度、26.85±1.26度；抗拉強(qiáng)度分別為2.97±0.6Mpa、1.88±0.12Mpa、1.63±0.15Mpa；斷裂伸長率分別為450.62±63.89%、327.76±15.72%、309.16±15.92%。 3.激光共聚焦顯微鏡觀察HA-1/SR組和HA-2/SR組材料表面生長的細(xì)胞與正常組相比，細(xì)胞骨架發(fā)生了重排；而純SR組材料表面細(xì)胞中微絲排列稀疏且有回縮跡象。 4. CCK-8法檢測(cè)材料表面細(xì)胞的增殖情況及細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，正常組、純SR組、HA-1/SR組和HA-2/SR組的吸光度（OD）分別為1.0539±0.0314、0.8511±0.0381、1.3877±0.0239、1.328±0.0359，由此可見HA-1/SR組和HA-2/SR組細(xì)胞增殖明顯（P0.05），而純SR組細(xì)胞的增殖受限（P0.05）。通過各組OD值計(jì)算所得的相對(duì)增殖率（RGR）分別為100%、76.39%、138.86%、131.91%，根據(jù)RGR判斷出HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料毒性等級(jí)為0級(jí)，而純SR的毒性等級(jí)為1級(jí)。 5. Hoechst33342和PI雙染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與凋亡組比較，純SR組、HA-1/SR組和HA-2/SR組表面生長的細(xì)胞均未對(duì)PI著色，且在Hoechst33342染色后，細(xì)胞核呈現(xiàn)正常的形狀和顏色，未發(fā)生凋亡或壞死。 6. Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組相比，HA-1/SR組和HA-2/SR組的細(xì)胞中vinculin mRNA、OPN mRNA表達(dá)明顯增高（P0.05），而HA-1/SR組與HA-2/SR組比較，vinculin mRNA和OPN mRNA表達(dá)增高（P0.05），純SR組細(xì)胞中vinculinmRNA、OPN mRNA的表達(dá)均有所降低（P0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HA/SR涂層材料更利于細(xì)胞粘附作用。 7. Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組比較，HA-1/SR組和HA-2/SR組細(xì)胞中vinculin蛋白和OPN蛋白的表達(dá)水平明顯增高（P0.05），HA-1/SR組與HA-2/SR組比較，vinculin蛋白和OPN蛋白表達(dá)增高（P0.05），而純SR組細(xì)胞中vinculin蛋白和OPN蛋白的表達(dá)則明顯低于正常組細(xì)胞（P0.05）。 結(jié)論 1. HA/SR涂層材料制作方法簡單，便于生產(chǎn)和加工。 2. HA-1/SR和HA-2/SR在力學(xué)性能和理化性能等方面符合國家醫(yī)用軟組織填充材料的使用要求。 3.在體外試驗(yàn)中，HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料與純SR相比，明顯改善了材料表面的細(xì)胞粘附性及生物活性，所以涂層材料更適合應(yīng)用于人體，并且HA-1/SR更優(yōu)于HA-2/SR。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2257083