【摘要】：研究背景及目的:在節(jié)段性骨缺損修復、四肢關節(jié)重建、脊柱融合等臨床治療中,常需要進行骨移植。自體骨和同種異體骨等骨修復材料因自身固有缺陷而在臨床應用中受到極大限制。人工骨因其可大批量生產、便于儲存運輸等特點,成為近年來骨修復材料領域的研究熱點。目前已有多種類型的人工骨應用于臨床,以磷酸鈣骨水泥、羥基磷灰石和可降解有機材料等為主,主要用于非結構性植骨。但這些人工骨的骨修復效果有限或不佳,遠遜于自體骨或異體骨,其主要原因是不具備骨誘導活性。生長因子可以促進間充質干細胞的增殖、分化,可有效促進新骨的形成,將其復合到人工骨支架上,將有望賦予人工骨有效的誘導成骨活性。但生長因子的半衰期很短,直接使用將很快被降解或稀釋,不能在骨修復局部形成有效持久的藥物濃度。不僅使用量大,經濟成本高,而且隨血液分布到機體其他部位,可能出現(xiàn)并發(fā)癥。因此,如何構建一種有效的生長因子緩釋系統(tǒng)成為該領域發(fā)展需解決的一大關鍵難題。聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)納米粒在藥劑學方面的快速發(fā)展為骨科醫(yī)生帶來了啟示。PLGA是一種人工合成的高分子聚合物,可作為多種藥物的載體而實現(xiàn)體內的持久釋放。如果使用PLGA作為載體對生長因子進行負載,則有望實現(xiàn)生長因子在體內的緩慢釋放,從而在骨修復局部維持足夠的濃度,充分發(fā)揮它們的促成骨功能。將這個緩釋系統(tǒng)同人工骨主體支架復合,則有望制備出具有較高成骨活性的復合人工骨,來滿足臨床對理想骨修復材料的需求。本課題組擬篩選一種PLGA作為主體材料建立納米粒緩釋系統(tǒng),對制備條件進行探索優(yōu)化,使之更高效地包封蛋白質類物質,能有效地保護蛋白質的生物學活性,并可穩(wěn)定釋放這些物質達一個月以上,為制備出高活性的人工骨修復材料打下基礎。方法:(1)查閱相關文獻,根據對緩釋系統(tǒng)的實際需求和生長因子的性質,最終選擇分子量較低、乳酸與乙醇酸單體比例為50:50的PLGA作為納米粒制備的主體材料。采用復乳溶劑揮發(fā)法(W/O/W)制備納米粒,以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白,探索PLGA濃度、BSA與PLGA質量比、內水相與油相體積比、內水相溶劑類型等因素對制備PLGA納米粒的影響,通過測定蛋白的包封率并兼顧載藥率來尋找最優(yōu)制備條件。(2)通過優(yōu)化條件制備納米粒,分別研究其對BSA、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rh BMP-2)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh FGF-2)的體外釋放動力學,評價其對蛋白質的緩釋效果。(3)與間充質干細胞共培養(yǎng),用CCK-8法和livedead染色來證實PLGA納米粒的生物相容性。(4)利用細胞增殖實驗來驗證rh FGF-2/PLGA納米粒的生物學活性,利用堿性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性檢測、骨鈣素(OCN)含量檢測、成骨相關標志物的表達等來驗證rh BMP-2/PLGA納米粒的生物學活性。結果:(1)成功制備了PLGA納米粒并優(yōu)化了制備條件,當PLGA濃度為200mg/m L、BSA與PLGA質量比為1:40、水油體積比1:10、內水相使用去離子水時可獲得對BSA最理想的包封率和載藥率。(2)制備的納米粒呈規(guī)則球形,粒徑在300 nm左右,對BSA、rh BMP-2、rh FGF-2的包封率分別為(70.0±1.3)%、(68.2±1.7)%、(66.8±2.9)%。(3)納米�？蓪崿F(xiàn)蛋白類物質的持久緩慢釋放,長達一個月以上,突釋現(xiàn)象不明顯。(4)納米粒的生物相容性良好,與間充質干細胞共培養(yǎng)3天,細胞存活力好。(5)rh FGF-2/PLGA納米粒對細胞有明顯促增殖作用,共培養(yǎng)7天后其促增殖作用顯著強于rh FGF-2溶液組(p0.05)。ALP染色、ALP活性檢測、骨鈣素含量檢測、成骨相關標志物表達結果證實rh BMP-2/PLGA納米粒對C2C12細胞具有促成骨分化作用,且顯著強于rh BMP-2溶液組(p0.05)。結論:以優(yōu)化條件制備的PLGA納米粒呈規(guī)則球形,對蛋白質的包封效率高,能實現(xiàn)一個月以上的緩慢釋放,具有良好的生物相容性,利用PLGA納米粒負載的rh BMP-2、rh FGF-2仍具有良好的生物學活性,且表現(xiàn)出比直接使用相同劑量的相應生長因子溶液更優(yōu)效的作用。PLGA納米粒適宜作為生長因子的緩釋載體,為賦予人工骨高成骨誘導活性提供了新的選擇。
[Abstract]:BACKGROUND AND OBJECTIVE: Bone transplantation is often needed in the clinical treatment of segmental bone defect repair, limb joint reconstruction, spinal fusion and so on. Many types of artificial bone have been used in clinic, mainly calcium phosphate cement, hydroxyapatite and biodegradable organic materials, mainly for non-structural bone grafting. However, the effect of bone repair of these artificial bone is limited or poor, far inferior to that of autogenous bone or allogeneic bone, and the main reason is that these artificial bone grafts are mainly used in non-structural bone grafting. Growth factors can promote the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells and promote the formation of new bone effectively. When they are combined with artificial bone scaffolds, they are expected to endow artificial bone with effective osteogenic activity. As a result, how to construct an effective growth factor sustained-release system has become a key problem in this field. Poly (lactic acid-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles are used in pharmaceuticals. PLGA is a synthetic polymer that can be used as a carrier for many drugs to achieve sustained release in vivo. If PLGA is used as a carrier to load growth factors, it is expected to achieve slow release of growth factors in vivo, thus maintaining adequate local bone repair. It is hoped that the composite artificial bone with high osteogenic activity can be prepared to meet the clinical demand for ideal bone repair materials. Our team is going to select a kind of PLGA as the main material to establish nanoparticle sustained-release system for preparation. Conditions were optimized to encapsulate protein substances more efficiently, protect the biological activity of protein effectively, and release these substances steadily for more than one month, laying a foundation for the preparation of highly active artificial bone repair materials. PLGA with low molecular weight and 50:50 ratio of lactic acid to glycolic acid monomer was chosen as the main material for the preparation of nanoparticles. (2) The in vitro release kinetics of PLGA nanoparticles to BSA, recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rh BMP-2) and recombinant human basic fibroblast growth factor-2 (rh FGF-2) were studied by optimizing the preparation conditions. To evaluate the sustained-release effect of rh-FGF-2/PLGA nanoparticles. (3) The biocompatibility of PLGA nanoparticles was confirmed by co-culture with mesenchymal stem cells, CCK-8 method and livedead staining. (4) The biological activity of rh-FGF-2/PLGA nanoparticles was verified by cell proliferation test, alkaline phosphatase (ALP) staining, ALP activity detection, osteocalcin (OCN) content detection, osteogenesis. Results: (1) PLGA nanoparticles were successfully prepared and the preparation conditions were optimized. When the concentration of PLGA was 200 mg/ml, the mass ratio of BSA to PLGA was 1:40, the volume ratio of water to oil was 1:10, and the deionized water was used in the inner water phase, the best encapsulation efficiency and drug loading rate of BSA were obtained. The encapsulation efficiency of BSA, RH BMP-2 and Rh FGF-2 was (70.0 6550 After co-culture for 3 days, the cell viability was good. (5) Rh-FGF-2/PLGA nanoparticles could promote the proliferation of C2C12 cells significantly. After co-culture for 7 days, the proliferation-promoting effect of rh-FGF-2 nanoparticles was significantly stronger than that of rh-FGF-2 solution group (p0.05). ALP staining, ALP activity detection, osteocalcin content detection, osteogenesis-related markers expression results confirmed that rh-BMP-2/PLGA nanoparticles could promote the proliferation of C2C12 cells. CONCLUSION: PLGA nanoparticles prepared under the optimized conditions are regular spheres with high encapsulation efficiency for protein, can achieve slow release for more than a month, and have good biocompatibility. RhBMP-2 and rh-FGF-2 loaded with PLGA nanoparticles still have good biological activity. PLGA nanoparticles are suitable for sustained-release carrier of growth factors, which provides a new choice for endowing artificial bone with high osteogenic induction activity.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R687;R318.17

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王志清;劉衛(wèi);徐輝碧;楊祥良;;載三氧化二砷的PEG-PLGA隱性納米粒的制備及體外研究(英文)[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2007年06期

2 ;Effect of degradation of PLGA and PLGA/β-TCP scaffolds on the growth of osteoblasts[J];Chinese Science Bulletin;2011年10期

3 王晶,周慶頌,袁悅,莫鳳奎;生物降解聚合物PLGA-PEG-PLGA的合成及表征[J];沈陽藥科大學學報;2005年05期

4 曹穎光,王戎,王華均,吳慧華,胡立桉;骨髓間充質干細胞與PLGA體外附著的實驗研究[J];臨床口腔醫(yī)學雜志;2005年04期

5 于家傲;路來金;李玲玲;劉志剛;鄒廣田;;高壓合成HA/PLGA骨折內固定材料的體內外降解研究[J];中華手外科雜志;2006年01期

6 徐國富;牟申周;蔡惠;廖素三;陳蕾;尹志民;;三層式nCHAC/PLGA復合膜體外降解行為的研究[J];生物骨科材料與臨床研究;2006年02期

7 郭曉東;;Surface Modification of Biomimetic PLGA-(ASP-PEG) Matrix with RGD-Containing Peptide:a New Non-Viral Vector for Gene Transfer and Tissue Engineering[J];Journal of Wuhan University of Technology(Materials Science Edition);2006年03期

8 李艷妍;李立新;孫智輝;尹一子;;含紫杉醇PLGA緩釋微球的研制及理化性質[J];中國生物制品學雜志;2007年05期

9 陳劍;樊新;周忠誠;阮建明;;PLGA材料仿生改性的最新進展[J];粉末冶金材料科學與工程;2008年06期

10 李雙燕;;PLGA組織工程支架材料的研究與展望[J];國外絲綢;2009年02期

相關會議論文 前10條

1 鄭強;潘志軍;薛德挺;李杭;李建兵;;納米PLGA/HA復合物和骨髓基質干細胞在軟骨修復中的應用[A];2009年浙江省骨科學學術年會論文匯編[C];2009年

2 王漢杰;蘇文雅;廖振宇;王生;常津;;PLGA/Liposome核殼納米粒子的制備[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第30次學術年會暨生物醫(yī)學工程前沿科學研討會論文集[C];2010年

3 王光林;吳輝;;聯(lián)合靜電紡絲法和轉筒接收法制備PLGA—膠原—絲素納米神經導管[A];第六屆西部骨科論壇暨貴州省骨科年會論文匯編[C];2010年

4 趙潔;全大萍;廖凱榮;伍青;;含不同側氨基密度的ASP-PEG-PLGA的合成與表征[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2004年

5 黃艷霞;任天斌;張麗紅;呂凱歌;蔣欣泉;潘可風;任杰;;PLGA/NHA-RGD復合材料的制備及性能研究[A];2006年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2006年

6 ;Synthesis of PLGA Labeled with ~(125)I[A];2006年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2006年

7 李艷輝;崔媛;張慧敏;關秀文;;利用等離子體技術在PLGA表面固定膠原的研究[A];2011年全國高分子學術論文報告會論文摘要集[C];2011年

8 何樹;畢龍;劉建;扈剛;孟國林;董鑫;郝賦;趙軼男;;新型PLGA/HMS-HA復合微球載體支架對兔骨髓間充質干細胞生物學行為的影響[A];中華醫(yī)學會第七次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議論文匯編[C];2013年

9 ;Preparation of PLGA Ultrasound Microbubble Loaded Hematoporphyrin and optimization of formulation[A];中華醫(yī)學會第十次全國超聲醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2009年

10 李志宏;武繼民;汪鵬飛;陳學忠;黃姝杰;關靜;張西正;;BMP/PLGA緩釋微球的制備與體外釋放性能[A];第七屆中國功能材料及其應用學術會議論文集（第4分冊）[C];2010年

相關重要報紙文章 前3條

1 記者　白毅;合成溫敏型PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物[N];中國醫(yī)藥報;2006年

2 尹東鋒 鐘延強;聚合物 藥物 制備工藝 附加劑[N];中國醫(yī)藥報;2006年

3 李博;“人造紅細胞”[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

相關博士學位論文 前10條

1 李玉華;載阿倫磷酸鈉PLGA微球的磷酸鈣骨水泥復合組織工程骨修復兔股骨髁骨缺損的實驗研究[D];山東大學;2015年

2 周璇;RGD靶向微泡與載藥微球在肝臟創(chuàng)傷滲血診斷和治療中的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2015年

3 陶春;可注射鑲嵌載生長因子殼聚糖微球的PLGA多孔復合微球支架的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

4 鮑文;靶向納米載藥系統(tǒng)DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf治療惡性血液病的體內、體外研究[D];東南大學;2015年

5 王晨暉;裝載蛋白藥物的PCADK/PLGA混合微球研究及在重組人生長激素中的應用[D];吉林大學;2016年

6 盧明子;載血紅蛋白PEG-PLGA納米粒子的構建、生物學作用及其靶向性能的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2016年

7 張皓軒;載辛伐他汀PLGA微球/磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和成骨活性的研究[D];山東大學;2016年

8 李青;新型高效靶向ROS響應的載藥納米粒子系統(tǒng)在口腔鱗癌治療中的研究[D];山東大學;2016年

9 齊峰;粒徑均一的PLGA顆粒制備及在長效緩釋體系和Pickering乳液中的應用[D];中國科學院研究生院(過程工程研究所);2015年

10 劉苒;轉鐵蛋白修飾的新型多聚物載藥納米粒的研制及靶向逆轉白血病多藥耐藥的體外研究[D];東南大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 陽剛;復合肌腱修復材料—載細胞用防粘連性隔離/支架型PLGA膜的體外研制[D];中南大學;2010年

2 唐冠男;微流控技術原位合成多形貌PLGA/TiO_2復粒子及其體外藥物釋放的研究[D];華南理工大學;2015年

3 李文秀;形貌可控的PLGA/PCL復合粒子的制備及體外降解性能的基礎研究[D];華南理工大學;2015年

4 黃卓穎;重組人表皮生長因子PLGA納米粒經皮治療大鼠糖尿病潰瘍的作用研究[D];福建中醫(yī)藥大學;2015年

5 聞繼杰;含胺基修飾beta-環(huán)糊精的可降解兩親性聚酯的合成及其對蛋白質和抗癌藥物的控制釋放[D];天津理工大學;2015年

6 王翠偉;基于點擊化學制備PCL/PEG兩親性共網絡聚合物以及不同支臂PLGA作為疫苗載體的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

7 王共喜;PLA/AT納米復合材料的制備與性能及PLGA纖維的表面改性[D];復旦大學;2014年

8 劉青;植入體材料與PLGA載藥微球的復合研究[D];西南交通大學;2015年

9 張科技;蠶絲-PLGA支架的生物相容性及力學性能的研究[D];浙江省醫(yī)學科學院;2015年

10 黃曉君;關節(jié)腔注射用青藤堿-PLGA微球—溫敏凝膠的制備及評價[D];廣東藥學院;2015年

，

本文編號：2219476