本文選題：綠色熒光蛋白　切入點(diǎn)：生長因子受體結(jié)合蛋白2　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：熒光顯微成像技術(shù)極大地增強(qiáng)了人們了解生物功能分子信息的能力。綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)以及類GFP熒光蛋白(GFP-like fluorescent proteins)對(duì)于推動(dòng)這種進(jìn)步的技術(shù)層面的創(chuàng)新起到了極大的作用。各類熒光探針的開發(fā)和現(xiàn)代顯微技術(shù)的進(jìn)步,使我們能夠以更高的時(shí)空分辨率將生物功能直接可視化,這包括基因表達(dá)、蛋白和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)/細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)、蛋白間相互作用、蛋白構(gòu)象改變、蛋白翻譯后修飾、胞內(nèi)離子和小分子的濃度(改變)和酶活性等。 細(xì)胞的分泌途徑、內(nèi)吞途徑和自吞噬途徑等過程中的囊泡結(jié)構(gòu)吸引了很多研究者的興趣。人們雖然已經(jīng)揭示了這些生物膜結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)并提出了各種各樣的假說,但是,對(duì)于與這些結(jié)構(gòu)相聯(lián)系的蛋白的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及其機(jī)制仍不清楚。本研究采用FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)、FRAPa (fluorescence redistribution after photoactivation)和FRET (fluorescence resonance energy transfer)等動(dòng)態(tài)熒光顯微成像技術(shù),對(duì)選取的內(nèi)吞囊泡和自吞噬囊泡上的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)的研究,為深入理解生命過程中的蛋白功能提供了新的視角。主要結(jié)果如下： 1)利用發(fā)射光譜掃描、受體光漂白和熒光壽命等三種不同檢測(cè)方法比較基于熒光蛋白mCerulean/mCitrine的不同F(xiàn)RET對(duì)間的FRET效率。亦用受體光漂白法檢測(cè)到了EGF刺激后內(nèi)吞囊泡上EGFR-mCerulean與GRB2-mCitrine之間相互作用的FRET信號(hào)。 2)以內(nèi)吞囊泡上募集的GRB2-mCitrine為模型,進(jìn)行了定量的FRAP分析。結(jié)果顯示質(zhì)膜、早期內(nèi)涵體膜及晚期內(nèi)涵體／溶酶體膜上GRB2-mCitrine與胞漿存在快速交換過程,這表明GRB2-mCitrine與EGFR-mCerulean間的相互作用是瞬時(shí)的。在質(zhì)膜內(nèi)吞囊泡處,我們也測(cè)得SHC4蛋白與胞漿存在較大程度交換。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道包被蛋白小泡(coated vesicles)上的包被蛋白(如clathrin輕鏈及重鏈蛋白)及其它組分如AP1、AP2和GGA1也存在交換,即便這些囊泡與本體膜的脫離過程被抑制也是如此。所有這些關(guān)于蛋白動(dòng)態(tài)交換的現(xiàn)象,提示著內(nèi)吞囊泡表面分子的解離與親和是高度動(dòng)態(tài)的。 3)使用FRAP、FRAPa和FRET等動(dòng)態(tài)顯微成像技術(shù),發(fā)現(xiàn)LC3與蛋白聚集體有快速的親和與解離,但是與自吞噬囊泡的結(jié)合很穩(wěn)定。利用LC3在這兩種不同結(jié)構(gòu)上的動(dòng)力學(xué)差異性,可通過活細(xì)胞中定性的FRAP分析來判定一個(gè)FP-LC3斑點(diǎn)是在蛋白聚集體上還是自吞噬囊泡結(jié)構(gòu)。 4)發(fā)現(xiàn)自吞噬早期結(jié)構(gòu)上,PtdIns3P的效應(yīng)蛋白ZFYVE1僅展示了極少的恢復(fù),而另一個(gè)PtdIns3P效應(yīng)蛋白WIPI1卻表現(xiàn)出快的和很大程度的恢復(fù)。這些結(jié)果提示雖然很多ATG蛋白募集到自吞噬囊泡形成部位,但是它們的動(dòng)力學(xué)特性可能很不相同。 5)證明了IBs中成分組織涉及到了有序的分子相互作用。FRET和FRAP分析結(jié)果表明在活細(xì)胞中LC3/LC3G12OA與SQSTM1C端的LIR (LC3-interacting region)有作用并且這種親和是瞬時(shí)的。FRET結(jié)果表明蛋白聚集體中SQSTM1的排列是有規(guī)則的,即SQSTM1的N端之間很靠近,在有效的FRET半徑內(nèi),而N端和C端間則距離較遠(yuǎn),超出了有效的FRET半徑。 6)通過將SQSTM1蛋白突變體導(dǎo)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),建立了一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自吞噬體系。另外,結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自吞噬是通過將ATG蛋白募集到特定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部來誘導(dǎo)自吞噬囊泡的形成。 綜上所述,本研究闡明了EGFR內(nèi)吞囊泡上接頭蛋白GRB2的動(dòng)力學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)了LC3在蛋白聚集體和自吞噬囊泡這兩種不同結(jié)構(gòu)上的動(dòng)力學(xué)差異性,進(jìn)一步闡釋了蛋白聚集體成分的動(dòng)態(tài)性和組成的有序性。本文的研究確立了定量自吞噬過程動(dòng)力學(xué)的有趣和有用的光學(xué)成像方法,也表明了內(nèi)吞囊泡的高度動(dòng)態(tài)性,為進(jìn)一步的研究提供了技術(shù)上和研究對(duì)象上的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Fluorescence microscopic imaging techniques have greatly enhanced the ability of people to understand the biological function of molecular information. Green fluorescent protein (Green fluorescent, protein, GFP) and GFP (GFP-like fluorescent proteins) fluorescent protein has great effect to the innovation of technology level to promote the progress of the development. All kinds of fluorescent probes and modern micro technology that allows us to higher temporal and spatial resolution will direct visualization of biological functions, including gene expression, protein and cellular structure / organelle dynamics, protein-protein interactions, protein conformational changes, protein post-translational modifications, the intracellular concentration of ions and small molecules (change) and enzyme activity.
The secretory pathway of the cell, the endocytic pathway and self consuming ways in the vesicle structure has attracted much research interest. Although people have revealed the molecular basis of these biofilm structure and put forward various hypothesis, however, for the dynamic properties associated with the structure of the protein and its mechanism is still not sure. This study uses FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), FRAPa (fluorescence redistribution after photoactivation) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) dynamic fluorescence microscopic imaging technique, the selection of endocytic vesicles and autophagy vesicles on the protein dynamics research, provides a new perspective for deep understanding of life in the process of protein function. The main results are as follows:
1) by emission spectroscopy scanning, acceptor photobleaching and fluorescence lifetime of three different detection methods based on FRET efficiency of different FRET fluorescent protein mCerulean/mCitrine on the acceptor photobleaching method. Also used to detect EGF stimulates FRET signaling interaction between EGFR-mCerulean and GRB2-mCitrine after endocytic vesicles.
2) within the endocytic vesicles by the GRB2-mCitrine model, the quantitative analysis of FRAP. The results showed that the plasma membrane, the early endosome membrane and late endosomes / lysosomes membrane and intracellular GRB2-mCitrine rapid exchange process, which indicates that the interaction between EGFR-mCerulean and GRB2-mCitrine is instantaneous. The endocytic vesicles in the plasma membrane. We also measured SHC4 protein and cytoplasmic large degree of exchange. According to Literature coated vesicles (coated vesicles) on the envelope protein (such as the clathrin light chain and heavy chain protein) and other components such as AP1, AP2 and GGA1 are exchanged, even from these vesicles and the body membrane process the suppressed as well. All of these proteins on dynamic exchange phenomenon, suggests that the dissociation of endocytic vesicle surface molecules with affinity is highly dynamic.
3) the use of FRAP, FRAPa and FRET dynamic imaging technology, found that LC3 and protein aggregates have affinity and dissociation of fast, but the combination of autophagy and vesicles are stable. The use of LC3 in these two kinds of different structure on the dynamics of FRAP through the qualitative analysis of living cells to determine a FP-LC3 dot is in protein aggregates or autophagic vesicles.
4) found that autophagy early on the structure, the effect of the PtdIns3P protein ZFYVE1 demonstrated only minimal recovery, while another PtdIns3P effect protein WIPI1 has shown rapid and largely restored. These results suggest that although many ATG protein raised autophagic vesicle formation sites, but their dynamics are not the same.
5) proved that the components of tissue IBs involved in ordered molecular interaction between.FRET and FRAP analysis showed that LC3/LC3G12OA and SQSTM1C LIR in living cells (LC3-interacting region) and the role of affinity is instantaneous.FRET results showed that SQSTM1 protein aggregates are arranged in a regular, i.e. between SQSTM1 N end very close to the FRET, in the effective radius of the inner side of the C and N, and between the distance, beyond the radius of FRET effectively.
6) by introducing the SQSTM1 protein mutant into the endoplasmic reticulum, an endoplasmic reticulum autophagy system was established. Moreover, the results showed that the endoplasmic reticulum autophagy was induced by the recruitment of ATG protein into the specific endoplasmic reticulum part to induce the formation of autophagic vesicles.
In summary, this study illustrates the dynamic properties of EGFR endocytic vesicles on the adaptor protein GRB2, LC3 was found in protein aggregates and autophagy vesicles of these two kinds of different structure on the dynamics, further explained the order of the dynamic characteristics and composition of protein aggregates composition. This paper established a quantitative self interesting and useful imaging method of phagocytic process dynamics, also shows that the highly dynamic endocytic vesicles, provides technical basis and research object for further research.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R310

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本文編號(hào)：1634290