本文關鍵詞：激活TRPV4受體對海馬神經元存活的作用及其分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景瞬時感受器電位香草素受體亞家族IV型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬時感受器電位受體家族成員之一。該受體廣泛分布在中樞神經系統(tǒng)中,在海馬、大腦皮層、丘腦、小腦等腦區(qū)均有較多表達。TRPV4受體是一種“多覺型”受體,可以被多種因素如細胞水腫、溫熱刺激、花生四烯酸及其代謝產物等激活,該受體激活后引起以鈣離子為主的陽離子內流,導致細胞內游離鈣離子濃度升高。資料報道,給予TRPV4受體激動劑可以劑量依賴性地引起視網膜節(jié)細胞死亡,并介導次聲所致的神經元損傷。但是TRPV4受體引起細胞死亡的機制目前尚不清楚。腦缺血時由于能量代謝障礙可以導致細胞毒性水腫和細胞膜脂質代謝障礙,而這些病理改變均可以激活TRPV4受體。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注過程中,TRPV4受體蛋白表達增加,給予TRPV4受體阻斷劑可以明顯減少腦梗死體積。離體實驗也證明阻斷TRPV4受體可以減輕氧化應激對海馬星形膠質細胞的損傷,對氧糖剝奪導致的海馬CA1神經元損傷也具有保護作用。以上報導提示TRPV4受體是介導缺血性腦損傷的一個重要靶點。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號通路是控制細胞的增殖、分化、存活和死亡的重要胞內信號通路之一;而磷酸肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路是一個經典的抗凋亡、促進細胞存活的信號轉導通路。腦缺血時,MAPK信號通路被過度激活,而Akt信號通路被抑制是介導神經損傷的重要原因。在培養(yǎng)的脂肪細胞上,TRPV4受體激動劑可以增加細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK(extracellular regulated protein kinases,ERK)和C-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)的磷酸化水平。在血管內皮細胞上,激活TRPV4受體后可以激活PI3K。在多囊腎大鼠的膽管上皮細胞上,給予TRPV4受體激動劑可以增加Akt磷酸化水平,降低ERK磷酸化水平。以上資料提示激活TRPV4受體可以調節(jié)MAPK和PI3K/Akt信號通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)給予TRPV4激動劑對N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)介導的電流具有增強作用,提示激活TRPV4受體可以增強NMDA受體的功能。基于上述報道和前期的研究,本課題提出激活TRPV4受體通過調節(jié)NMDA受體及其下游的MAPK或PI3K/Akt信號通路介導細胞損傷,參與缺血性腦損傷的過程,為臨床治療缺血性腦損傷提供新靶點和理論依據(jù)。研究目的1.明確激活TRPV4受體對海馬神經元存活的作用及其機制。2.闡明TRPV4受體介導缺血性腦損傷的機制。第一部分激活TRPV4受體對海馬神經元存活的作用及其機制材料與方法1.制備激活TRPV4受體的在體模型:側腦室注射不同濃度劑量的TRPV4受體激動劑GSK1016790A,制備激活TRPV4受體的在體模型。2.組織化學染色:腦組織固定后石蠟包埋切片,用甲苯胺藍染色觀察GSK1016790A對海馬CA1和CA2/3區(qū)神經元存活的作用。3.蛋白印跡(Western blot):檢測GSK1016790A對海馬組織目標蛋白表達的作用。結果1.側腦室注射GSK1016790A在(0.1~5μM/小鼠)濃度范圍內能劑量依賴性地導致海馬CA1區(qū)和CA2/3區(qū)神經元死亡。2.給予GSK1016790A能增加NMDA受體NR2B亞基磷酸化水平。3.給予GSK1016790A能增加ERK的磷酸化(phosphorylation of ERK,pERK)水平,并降低Akt的磷酸化(phosphorylation of Akt,p-Akt)水平;給予NR2B亞基受體的阻斷劑Ro25-6981能有效阻斷GSK1016790A對pERK和p-Akt的調節(jié)作用。4.給予NR2B的阻斷劑Ro25-6981或PI3K的激動劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的神經毒性作用,但是給予MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase/ERK kinase,MEK)的阻斷劑U0126不能阻斷GSK1016790A所致的神經毒性作用。結論激活TRPV4受體通過磷酸化NMDA受體的NR2B亞基,下調Akt信號通路,進而導致神經損傷作用。第二部分TRPV4受體介導缺血性腦損傷的機制材料與方法1.腦缺血再灌注模型制備:運用血管內線栓法阻塞右側大腦中動脈60 min,制備大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的小鼠模型。2.腦梗死體積測定:MCAO再灌注后24 h和48 h的腦片置于氯化三苯基四氮唑(tetrazolium chloride,TTC)溶液中反應,正常腦組織呈紅色,而梗死組織呈白色,白色腦組織體積即為MCAO后腦梗死體積。3.Hoechst染色:MCAO再灌注48 h的腦片進行Hoechst染色以觀察海馬神經元的凋亡。4.蛋白印跡(Western blot):檢測MCAO再灌注不同時間點海馬組織目標蛋白表達水平。結果1.腦缺血再灌注1~24 h內p-ERK蛋白水平增高,p-ERK蛋白增加程度隨著再灌注時間的延長逐漸下降。2.腦缺血再灌注1~24 h內p-Akt蛋白水平在再灌注1~4 h內增加,隨著再灌注時間的延長,p-Akt水平明顯下降。3.側腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047(10μM/鼠)能有效減小MCAO再灌注24 h和48 h腦梗死體積,并能有效降低p-ERK蛋白水平、增加pAkt蛋白水平。4.側腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047(10μM/鼠)能有效抑制MCAO再灌注48 h海馬CA1區(qū)的細胞凋亡,提高Bcl-2/Bax蛋白比值,抑制caspse-3剪切體蛋白水平。5.側腦室注射TRPV4受體激動劑GSK1016790A能降低Bcl-2/Bax蛋白比值,增加caspse-3剪切體蛋白水平,給予PI3K激動劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的上述作用。結論綜合本課題實驗結果和課題組前期的研究,在腦缺血時,TRPV4受體被過度激活,通過增強NMDA受體NR2B亞基的功能下調Akt信號通路,進而降低Bcl-2/Bax蛋白比值,激活caspase-3,導致細胞凋亡和神經損傷,這是TRPV4受體介導腦缺血時神經損傷的重要機制之一。
【關鍵詞】：瞬時感受器電位香草素受體亞家族IV型 神經毒性作用 NMDA受體 ERK信號通路 Akt信號通路 瞬時感受器電位香草素受體亞家族IV型 腦缺血 凋亡 ERK信號通路 Akt信號通路
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-15
• 第一部分 激活TRPV4受體對海馬神經元存活的作用 及其機制15-33
• 前言15-17
• 材料和方法17-23
• 實驗結果23-28
• 討論28-29
• 小結29-30
• 參考文獻30-33
• 第二部分TRPV4受體介導缺血性腦損傷的機制33-55
• 前言33-35
• 材料和方法35-42
• 實驗結果42-49
• 討論49-51
• 小結51-52
• 參考文獻52-55
• 綜述55-69
• 參考文獻64-69
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況69
• 攻讀學位期間發(fā)表會議論文69-70
• 致謝70

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