本文關(guān)鍵詞：激活TRPV4受體對海馬神經(jīng)元存活的作用及其分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景瞬時(shí)感受器電位香草素受體亞家族IV型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬時(shí)感受器電位受體家族成員之一。該受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,在海馬、大腦皮層、丘腦、小腦等腦區(qū)均有較多表達(dá)。TRPV4受體是一種“多覺型”受體,可以被多種因素如細(xì)胞水腫、溫?zé)岽碳�、花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物等激活,該受體激活后引起以鈣離子為主的陽離子內(nèi)流,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高。資料報(bào)道,給予TRPV4受體激動(dòng)劑可以劑量依賴性地引起視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞死亡,并介導(dǎo)次聲所致的神經(jīng)元損傷。但是TRPV4受體引起細(xì)胞死亡的機(jī)制目前尚不清楚。腦缺血時(shí)由于能量代謝障礙可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫和細(xì)胞膜脂質(zhì)代謝障礙,而這些病理改變均可以激活TRPV4受體。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注過程中,TRPV4受體蛋白表達(dá)增加,給予TRPV4受體阻斷劑可以明顯減少腦梗死體積。離體實(shí)驗(yàn)也證明阻斷TRPV4受體可以減輕氧化應(yīng)激對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷,對氧糖剝奪導(dǎo)致的海馬CA1神經(jīng)元損傷也具有保護(hù)作用。以上報(bào)導(dǎo)提示TRPV4受體是介導(dǎo)缺血性腦損傷的一個(gè)重要靶點(diǎn)。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號(hào)通路是控制細(xì)胞的增殖、分化、存活和死亡的重要胞內(nèi)信號(hào)通路之一;而磷酸肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路是一個(gè)經(jīng)典的抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。腦缺血時(shí),MAPK信號(hào)通路被過度激活,而Akt信號(hào)通路被抑制是介導(dǎo)神經(jīng)損傷的重要原因。在培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞上,TRPV4受體激動(dòng)劑可以增加細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK(extracellular regulated protein kinases,ERK)和C-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)的磷酸化水平。在血管內(nèi)皮細(xì)胞上,激活TRPV4受體后可以激活PI3K。在多囊腎大鼠的膽管上皮細(xì)胞上,給予TRPV4受體激動(dòng)劑可以增加Akt磷酸化水平,降低ERK磷酸化水平。以上資料提示激活TRPV4受體可以調(diào)節(jié)MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)給予TRPV4激動(dòng)劑對N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)介導(dǎo)的電流具有增強(qiáng)作用,提示激活TRPV4受體可以增強(qiáng)NMDA受體的功能�；谏鲜鰣�(bào)道和前期的研究,本課題提出激活TRPV4受體通過調(diào)節(jié)NMDA受體及其下游的MAPK或PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞損傷,參與缺血性腦損傷的過程,為臨床治療缺血性腦損傷提供新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。研究目的1.明確激活TRPV4受體對海馬神經(jīng)元存活的作用及其機(jī)制。2.闡明TRPV4受體介導(dǎo)缺血性腦損傷的機(jī)制。第一部分激活TRPV4受體對海馬神經(jīng)元存活的作用及其機(jī)制材料與方法1.制備激活TRPV4受體的在體模型:側(cè)腦室注射不同濃度劑量的TRPV4受體激動(dòng)劑GSK1016790A,制備激活TRPV4受體的在體模型。2.組織化學(xué)染色:腦組織固定后石蠟包埋切片,用甲苯胺藍(lán)染色觀察GSK1016790A對海馬CA1和CA2/3區(qū)神經(jīng)元存活的作用。3.蛋白印跡(Western blot):檢測GSK1016790A對海馬組織目標(biāo)蛋白表達(dá)的作用。結(jié)果1.側(cè)腦室注射GSK1016790A在(0.1~5μM/小鼠)濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性地導(dǎo)致海馬CA1區(qū)和CA2/3區(qū)神經(jīng)元死亡。2.給予GSK1016790A能增加NMDA受體NR2B亞基磷酸化水平。3.給予GSK1016790A能增加ERK的磷酸化(phosphorylation of ERK,pERK)水平,并降低Akt的磷酸化(phosphorylation of Akt,p-Akt)水平;給予NR2B亞基受體的阻斷劑Ro25-6981能有效阻斷GSK1016790A對pERK和p-Akt的調(diào)節(jié)作用。4.給予NR2B的阻斷劑Ro25-6981或PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的神經(jīng)毒性作用,但是給予MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase/ERK kinase,MEK)的阻斷劑U0126不能阻斷GSK1016790A所致的神經(jīng)毒性作用。結(jié)論激活TRPV4受體通過磷酸化NMDA受體的NR2B亞基,下調(diào)Akt信號(hào)通路,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)損傷作用。第二部分TRPV4受體介導(dǎo)缺血性腦損傷的機(jī)制材料與方法1.腦缺血再灌注模型制備:運(yùn)用血管內(nèi)線栓法阻塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈60 min,制備大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的小鼠模型。2.腦梗死體積測定:MCAO再灌注后24 h和48 h的腦片置于氯化三苯基四氮唑(tetrazolium chloride,TTC)溶液中反應(yīng),正常腦組織呈紅色,而梗死組織呈白色,白色腦組織體積即為MCAO后腦梗死體積。3.Hoechst染色:MCAO再灌注48 h的腦片進(jìn)行Hoechst染色以觀察海馬神經(jīng)元的凋亡。4.蛋白印跡(Western blot):檢測MCAO再灌注不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.腦缺血再灌注1~24 h內(nèi)p-ERK蛋白水平增高,p-ERK蛋白增加程度隨著再灌注時(shí)間的延長逐漸下降。2.腦缺血再灌注1~24 h內(nèi)p-Akt蛋白水平在再灌注1~4 h內(nèi)增加,隨著再灌注時(shí)間的延長,p-Akt水平明顯下降。3.側(cè)腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047(10μM/鼠)能有效減小MCAO再灌注24 h和48 h腦梗死體積,并能有效降低p-ERK蛋白水平、增加pAkt蛋白水平。4.側(cè)腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047(10μM/鼠)能有效抑制MCAO再灌注48 h海馬CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡,提高Bcl-2/Bax蛋白比值,抑制caspse-3剪切體蛋白水平。5.側(cè)腦室注射TRPV4受體激動(dòng)劑GSK1016790A能降低Bcl-2/Bax蛋白比值,增加caspse-3剪切體蛋白水平,給予PI3K激動(dòng)劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的上述作用。結(jié)論綜合本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果和課題組前期的研究,在腦缺血時(shí),TRPV4受體被過度激活,通過增強(qiáng)NMDA受體NR2B亞基的功能下調(diào)Akt信號(hào)通路,進(jìn)而降低Bcl-2/Bax蛋白比值,激活caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和神經(jīng)損傷,這是TRPV4受體介導(dǎo)腦缺血時(shí)神經(jīng)損傷的重要機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：瞬時(shí)感受器電位香草素受體亞家族IV型 神經(jīng)毒性作用 NMDA受體 ERK信號(hào)通路 Akt信號(hào)通路 瞬時(shí)感受器電位香草素受體亞家族IV型 腦缺血 凋亡 ERK信號(hào)通路 Akt信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-15
• 第一部分 激活TRPV4受體對海馬神經(jīng)元存活的作用 及其機(jī)制15-33
• 前言15-17
• 材料和方法17-23
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-28
• 討論28-29
• 小結(jié)29-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 第二部分TRPV4受體介導(dǎo)缺血性腦損傷的機(jī)制33-55
• 前言33-35
• 材料和方法35-42
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-49
• 討論49-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 綜述55-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表會(huì)議論文69-70
• 致謝70

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本文編號(hào)：501157