發(fā)布時(shí)間：2017-06-27 01:00

  本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇對(duì)魚(yú)藤酮致神經(jīng)元氧化損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是常見(jiàn)于中老年人的運(yùn)動(dòng)障礙性疾病,也是僅次于阿爾茨海癥的第二大慢性神經(jīng)退行性疾病,該病的主要病理學(xué)特點(diǎn)是黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失,并形成以a-突觸核蛋白、泛素、神經(jīng)絲蛋白為主的Lewy、體。據(jù)統(tǒng)計(jì),65歲以上人群中PD的發(fā)病率高達(dá)1.7%。隨著我國(guó)人口老齡化的加劇,PD的患病率逐年增加,嚴(yán)重威脅著中老年人的身心健康。因此,闡明PD的發(fā)病機(jī)制是迫切需要解決的問(wèn)題。諸多的研究已證實(shí)家族性PD與遺傳因素有關(guān),但90%的散發(fā)性PD的病因不清,尤其是黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的特異性退變至今未能完全解釋。早在上世紀(jì)90年代,因吸食含有N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)的海洛因,吸食者出現(xiàn)典型的PD癥狀,并且外源性MPTP可在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中復(fù)制出PD的動(dòng)物模型。由此,環(huán)境因素逐漸成為PD研究關(guān)注的焦點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示,長(zhǎng)期接觸殺蟲(chóng)劑和除草劑顯著增加PD的患病風(fēng)險(xiǎn)。魚(yú)藤酮是從植物毛魚(yú)藤中提取而來(lái)的廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中的殺蟲(chóng)劑,與1-甲基-4苯基吡啶離子(MPP+)結(jié)構(gòu)類(lèi)似,均有聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮可抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性,降低ATP合成,并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)積聚,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化損傷,最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡。給予魚(yú)藤酮處理的小鼠,不僅誘發(fā)類(lèi)似PD的癥狀表現(xiàn),還選擇性導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)目減少。臨床研究也證實(shí),PD患者脂質(zhì)過(guò)氧化物、DNA氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷顯著升高。同時(shí),機(jī)體氧自由基清除系統(tǒng)谷胱甘肽減少,過(guò)氧化氫酶活性下降,提示氧化應(yīng)激介導(dǎo)了PD神經(jīng)元凋亡。盡管上述研究表明魚(yú)藤酮參與了PD的氧化應(yīng)激,但具體魚(yú)藤酮導(dǎo)致神經(jīng)氧化損傷的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的闡明。白藜蘆醇是一種存在于葡萄、花生紅衣中的多酚類(lèi)天然化合物,是植物抵御外界侵襲的抗毒素。近年來(lái),因其廣泛的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老及神經(jīng)保護(hù)等作用,尤其是其抗氧化應(yīng)激的突出功效日益受到人們的關(guān)注。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可改善PD模型鼠的行為學(xué)改變,并增加紋狀體組織抗氧化酶活性。白藜蘆醇是沉默信號(hào)調(diào)控因子1(silence signal regulation fator1, SIRT1)最強(qiáng)的激活劑。SIRT1也是最先發(fā)現(xiàn)Sirtuin家族成員。通過(guò)去乙酰化作用,SIRT1可調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白質(zhì)修飾,從而參與細(xì)胞代謝、衰老及發(fā)育等一系列生理及病理過(guò)程。以往的研究報(bào)道,SIRT1可減少氧化應(yīng)激而保護(hù)血管功能,并能升高過(guò)氧化氫酶活性。過(guò)表達(dá)SIRT1顯著提高神經(jīng)元對(duì)氧自由基毒性損傷的耐受力。作為SIRT1的下游分子靶點(diǎn),絲／蘇氨酸蛋白激酶Akt1可被SIRT1去乙�；せ顬閜-Akt1,與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及蛋白合成等密切相關(guān),已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PD患者p-Akt1的活性降低。但SIRT1/Akt1信號(hào)通路是否介導(dǎo)了白藜蘆醇拮抗魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)氧化損傷作用尚不清楚�；谏鲜霰尘�,我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題,旨在深入探討魚(yú)藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的分子機(jī)制,觀察白藜蘆醇對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用,并分析SIRT1和Akt1在白藜蘆醇發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)中的作用。首先,我們建立了魚(yú)藤酮損傷的細(xì)胞模型。給予不同濃度的魚(yú)藤酮損傷PC12細(xì)胞后觀察形態(tài)變化,通過(guò)CCK8、LDH檢測(cè)分析細(xì)胞活性變化,發(fā)現(xiàn)暴露在不同濃度的魚(yú)藤酮中,細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷,細(xì)胞活性下降,且呈劑量依賴性。其次,在魚(yú)藤酮?dú)pPC12細(xì)胞24小時(shí)之前給予不同濃度的白藜蘆醇進(jìn)行預(yù)保護(hù),檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性變化,結(jié)果顯示,白藜蘆醇可抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。經(jīng)不同濃度的白藜蘆醇預(yù)保護(hù)PC12細(xì)胞2小時(shí)之后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了不同變化,隨著濃度的升高細(xì)胞活性增強(qiáng), 其中以251μM白藜蘆醇保護(hù)效果最明顯,較損傷組軸突變長(zhǎng),胞體變圓,細(xì)胞活性升高,而100μM的高濃度白藜蘆醇沒(méi)有保護(hù)效果,且加重了細(xì)胞損傷。然后,我們應(yīng)用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽DCFH-DA檢測(cè)、JC-1染色和Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)雙染技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平、線粒體膜電位的變化和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的氧化損傷、并增強(qiáng)線粒體功能及抑制細(xì)胞凋亡。和魚(yú)藤酮損傷組比較,給予25μM的白藜蘆醇2小時(shí)預(yù)保護(hù)后,細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯下降,細(xì)胞內(nèi)生成ROS減少,以及線粒體膜電位升高。為進(jìn)一步探討其中的分子機(jī)制接下來(lái)采用Real-timePCR和Western Blotting檢測(cè)了PC12細(xì)胞內(nèi)SIRT1和Akt1的mRNA表達(dá)量以及蛋白表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組比較,在魚(yú)藤酮損傷組檢測(cè)到SIRT1和Akt1的mRNA的表達(dá)量下降,SIRT1、p-Aktl的蛋白表達(dá)量下降,25μM白藜蘆醇預(yù)保護(hù)PC12細(xì)胞能夠部分逆轉(zhuǎn)這種下降。最后,在白藜蘆醇保護(hù)組中給予SDRT1的特異性抑制劑尼克酰胺,Akt1的抑制劑LY294002和MK-2206分別阻斷SIRT1/Aktl的表達(dá),以進(jìn)一步明確SIRT1/Aktl信號(hào)通路是否參與了白藜蘆醇的對(duì)抗魚(yú)藤酮損傷PC12細(xì)胞的作用。應(yīng)用SIRT1的特異性抑制劑,尼克酰胺抑制其生物活性,結(jié)果顯示PC12細(xì)胞活性下降,白藜蘆醇保護(hù)PC12的作用下降,SIRT1和p-Akt1蛋白表達(dá)均降低；然后給予Akt1的特異性抑制劑LY294002,抑制Akt1活性,同樣CCK8顯示細(xì)胞活性下降,SIRT1和p-Akt1蛋白表達(dá)降低。并且用Akt1的另一新型特異性抑制劑MK-2206結(jié)果同LY294402一致。分別加入阻斷劑之后,尼克酰胺降低了SIRT1在蛋白和mRNA水平的表達(dá),而LY294002和MK-2206作為Akt1的阻斷劑不僅阻斷了Akt1的激活也降低了SIRT1的表達(dá),這表明SIRT1和Akt1之間可能存在著相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。綜上所述,本項(xiàng)研究結(jié)果表明,魚(yú)藤酮可誘導(dǎo)神經(jīng)元ROS產(chǎn)生、線粒體功能損傷,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡；白藜蘆醇可通過(guò)抗氧化應(yīng)激拮抗魚(yú)藤酮導(dǎo)致的神經(jīng)元毒性損傷,其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)SIRT1/Aktl分子通路的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：魚(yú)藤酮 白藜蘆醇 線粒體 SIRT1 Akt1
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符號(hào)說(shuō)明12-13
• 前言13-16
• 實(shí)驗(yàn)材料16-20
• 實(shí)驗(yàn)方法20-28
• 結(jié)果28-33
• 討論33-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖表39-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 致謝54-55
• 碩士期間發(fā)表論文情況55-56
• 附件56

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本文編號(hào)：488048