本文關(guān)鍵詞：小鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、分化及其影響因素研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致的疾病,隨著時(shí)間的推移而加重,最終導(dǎo)致功能障礙。因其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,其病理機(jī)制至今尚未闡明,臨床治療尚無肯定而有效的措施。神經(jīng)干／祖細(xì)胞治療為這類疾病治療帶來了希望,但在干細(xì)胞臨床應(yīng)用之前,需要我們清楚干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制及干細(xì)胞定向分化策略,從而使之向指定的方向分化。調(diào)控干細(xì)胞增殖信號(hào)通路中,Rho/Rho(Ras homologue)激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路是焦點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)選擇Rho激酶抑制劑Y-27632將其運(yùn)用于小鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分化之中,研究Rho激酶抑制劑Y-27632對(duì)于小鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化的影響。[方法]選擇13-15天的C57胚胎期小鼠,分離獲得脊髓組織,使用胰酶消化并懸浮培養(yǎng)后獲得神經(jīng)干細(xì)胞,用免疫熒光染色法鑒定帶有神經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)記物Nestin和Sox2的細(xì)胞,將所獲得的神經(jīng)干細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,在實(shí)驗(yàn)組中加入Y-27632 (10μoml/L),研究Y-27632對(duì)神經(jīng)千細(xì)胞增殖、分化的作用。在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中,持續(xù)5-7代加入Y-27632,通過免疫熒光染色法、定量RT-PCR及Western-Blot蛋白水平檢測(cè)法等,檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞干性標(biāo)記、分化細(xì)胞標(biāo)記以及BrdU與Nestin雙陽性的細(xì)胞。在神經(jīng)干細(xì)胞含0.5%FBS的分化培養(yǎng)體系中加入Y-27632,用免疫熒光染色法、western blo、 RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞及其各分化細(xì)胞的情況,分析Y-27632對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。[結(jié)果]從13-15天胚胎期小鼠脊髓中分離培養(yǎng)獲得神經(jīng)干細(xì)胞,神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記Nestin(巢蛋白)陽性細(xì)胞純度高于90%。通過免疫熒光染色法、Western Blot和RT-PCR等方法,從細(xì)胞數(shù)量、蛋白表達(dá)水平和RNA水平比較發(fā)現(xiàn)：對(duì)懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,Y-27632抑制其增殖能力而促進(jìn)其分化。為進(jìn)一步驗(yàn)證Y-27632促進(jìn)分化的作用,在神經(jīng)干細(xì)胞自發(fā)分化體系中加入Y-27632。Y-27632促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為GFAP陽性細(xì)胞。[結(jié)論]Y-27632 (10μoml/L)對(duì)小鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的增殖無促進(jìn)作用；Y-27632有促進(jìn)小鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的作用。[目的]長期以來人們認(rèn)為哺乳動(dòng)物成體神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)通路出生后就固定不變的,中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦及脊髓受損將導(dǎo)致永久性的功能損失。然而,1992年Reynolds成功從成年小鼠紋狀體中培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞及1996年脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的成功培養(yǎng),說明出生以后神經(jīng)再生還持續(xù)存在,干細(xì)胞治療為神經(jīng)退行性疾病治愈提供了可能。人們對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的研究經(jīng)歷了從胚胎干細(xì)胞、胚胎時(shí)期培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞到從成體動(dòng)物神經(jīng)組織內(nèi)直接獲得神經(jīng)干細(xì)胞的研究過程。對(duì)前二者的研究,由于不可避免的移植排斥反應(yīng),應(yīng)用時(shí)需大劑量的免疫抑制劑。而從成體動(dòng)物體內(nèi)獲得神經(jīng)干細(xì)胞則沒有此方面的問題。但脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)較腦源性神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)困難。成體脊髓長度較長,含有大量的神經(jīng)纖維及髓鞘,本實(shí)驗(yàn)將研究成體脊髓各節(jié)段的神經(jīng)干細(xì)胞情況,系統(tǒng)比較各節(jié)段神經(jīng)干細(xì)胞的差異,尋找能更有效的培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞的方法。[方法]選擇8-12周的C57成年小鼠,分離獲得脊髓組織,按照頸、胸、腰、骶尾分為四段,經(jīng)酶消化并培養(yǎng)后獲得神經(jīng)干細(xì)胞,用免疫熒光染色法鑒定帶有神經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)記物Nestin和Sox2的細(xì)胞,并進(jìn)行計(jì)數(shù)比較；分別進(jìn)行傳代后,比較倍增數(shù)。各節(jié)段的神經(jīng)干細(xì)胞予以含0.5%FBS的分化培養(yǎng)基自然分化7天后,用免疫熒光染色法觀察形態(tài)。將小鼠的脊髓組織各節(jié)段分別進(jìn)行提取蛋白及RNA,通過Western Blot、 RT-PCR檢測(cè)比較其神經(jīng)干細(xì)胞含量。對(duì)脊髓各節(jié)段經(jīng)冰凍切片后,行免疫熒光染色后,比較神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量情況。[結(jié)果]從8-12周的C57成年小鼠中,分離脊髓組織經(jīng)酶消化培養(yǎng),成功獲得神經(jīng)干細(xì)胞,經(jīng)免疫熒光染色法鑒定帶有神經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)記物Nestin和Sox2的細(xì)胞,計(jì)數(shù)后比較培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量：胸段頸段腰段骶尾段。從細(xì)胞傳代倍增數(shù)上比較：胸段頸段腰段骶尾段。對(duì)脊髓組織不同節(jié)段在蛋白及RNA水平比較神經(jīng)干細(xì)胞含量：頸段胸段腰段骶尾段。脊髓組織進(jìn)行切片染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞含量：頸段胸段腰段骶尾段。[結(jié)論]成年C57小鼠脊髓各節(jié)段干細(xì)胞含量：頸段胸段腰段骶尾段。從細(xì)胞培養(yǎng)的有效性上,骶尾段含有的神經(jīng)纖維及髓鞘較頸、胸、腰段的少,神經(jīng)干細(xì)胞含量最多,體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞也最多。
【關(guān)鍵詞】：脊髓神經(jīng)干細(xì)胞 Y-27632 增殖 分化 GFAP 脊髓神經(jīng)干細(xì)胞 成體 Nestin 脊髓節(jié)段
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)5-7
• 第一部分：小鼠胎鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、分化及Y-27632對(duì)其增殖、分化的影響作用7-48
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-32
• 結(jié)果32-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 第二部分：小鼠成體脊髓神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、分化及各節(jié)段間神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量比較48-77
• 中文摘要48-50
• 英文摘要50-52
• 前言52-53
• 材料與方法53-66
• 結(jié)果66-74
• 討論74-75
• 結(jié)論75-76
• 參考文獻(xiàn)76-77
• 綜述77-86
• 參考文獻(xiàn)82-86
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果86-87
• 致謝87

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本文編號(hào)：482924