本文關(guān)鍵詞：腦動靜脈畸形內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腦動靜脈畸形(cerebral arteriovenous malformations,cAVM)是常見的顱內(nèi)血管性病變,是由動脈、靜脈及動脈化的靜脈組成的畸形的血管團。在胚胎早期,原始的動脈及靜脈是直接溝通的,以后由于局部毛細血管發(fā)育異常,動脈及靜脈仍然以直接溝通的形式遺留下來。臨床表現(xiàn)主要為反復發(fā)作的腦出血,其致殘率、致死率極高。在以往的研究中發(fā)現(xiàn),cAVM的病理性改變與供血動脈壓力、畸形團、引流靜脈、血流速度和盜血現(xiàn)象相關(guān)。其畸形血管團暴露在異常的高血流和剪切力下,會激活平滑肌細胞和大腦內(nèi)皮細胞的分子通路,導致內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞增殖和血管重構(gòu)。動物模型顯示,畸形血管團的病理改變包括:血管壁不同程度的增厚、彈力層的斷裂,內(nèi)皮細胞層的增厚,內(nèi)皮細胞間粘附連接的缺失,內(nèi)皮細胞連續(xù)不完整和絲狀偽足的缺乏。血管內(nèi)皮細胞作為cAVM形成機制的首要參與者,在cAVM的形成過程中起著至關(guān)重要的作用。找到高效、簡便的血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)的方法,建立血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)模型,是研究cAVM的形成機制的基礎(chǔ)。方法:選取經(jīng)核磁共振(The Magnetic Resonance Imaging,MRI)、血管造影(Digital Subtraction angiography,DSA)及手術(shù)病理切片明確診斷腦動靜脈畸形的患者10例,癲癇患者顳淺靜脈3例。以上標本均來自于北京天壇醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的患者。上述標本首先采用組織免疫熒光進行von Willebrand Factor(vWF)and a-smooth muscle action(a-SMA)抗體染色。剩余標本通過膠原酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)。經(jīng)流式細胞術(shù)對原代培養(yǎng)的細胞進行分選,篩選出Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,(PECAM-1/CD31)及CD144雙陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)。分選后細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài),再經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定內(nèi)皮細胞純度。將分選后的內(nèi)皮細胞經(jīng)細胞免疫熒光對CD31、CD144、vWF及α-SMA染色。測定內(nèi)皮細胞對Acetylated Low Density Lipoprotein labeled with 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate(Dil-Ac LDL)的吞噬能力,進一步證實經(jīng)該實驗方法原代培養(yǎng)的細胞為內(nèi)皮細胞。通過內(nèi)皮細胞遷移、侵襲及成管實驗,對培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的功能進行評估。比較動靜脈畸形患者內(nèi)皮細胞血管生成能力與正常內(nèi)皮之間的差異。結(jié)果:1一般資料本實驗共統(tǒng)計分析了cAVM患者10名,其中男性7例,女性3例。以腦出血為首發(fā)癥狀者7例,合并癲癇病史者有2例。10位患者顱內(nèi)動靜脈畸形病灶體積大小介于40~70mm之間。每位患者均采用手術(shù)治療,手術(shù)室取材后,進行血管細胞原代培養(yǎng),通過上述培養(yǎng)方法進行培養(yǎng),該實驗的成功例數(shù)為7例。腦動靜脈畸形從MRI及DSA影像學可見動靜脈畸形血管團顯影。2測定組織的vWF及α-SMA表達。對superficial temporal vein(STV)及cAVM組織行免疫熒光學檢測vWF及α-SMA的表達水平,結(jié)果所示,在STV及cAVM組可以看出,各組取材均有vWF及α-SMA的表達。vWF定位于內(nèi)皮細胞,而α-SMA定位于血管平滑肌細胞。3原代細胞培養(yǎng)的分選。通過流式細胞分析儀對原代培養(yǎng)的細胞進行分選,獲取CD31及CD144雙陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)。4分選后細胞的形態(tài)學觀察及流式細胞分析。分選后細胞倒置顯微鏡下可見,STV及cAVM組細胞為扁圓形或橢圓形,呈鋪路石樣排列。其中可見cAVM組細胞密度較STV組降低,呈抑制性生長。流式細胞分析結(jié)果可看出,該實驗方法得到內(nèi)皮細胞純度較高,其中cAVM組細胞CD31及CD144雙陽性比例為90.60%,STV組CD31及CD144雙陽性細胞比例為98.4%。5分選后細胞CD31、CD144、vWF、α-SMA的表達。通過細胞免疫熒光檢測STV組及cAVM組細胞CD31、CD144、vWF及α-SMA的表達。從免疫熒光結(jié)果可以看出,各組原代培養(yǎng)的細胞均有CD31、CD144及vWF的表達,證實內(nèi)皮細胞的純度。6分選后細胞Dil-Ac LDL吞噬實驗。從結(jié)果可以看出,STV組及cAVM組分選后培養(yǎng)細胞均有攝取脂質(zhì)的能力,進一步證實該實驗中原代培養(yǎng)細胞為內(nèi)皮細胞。7內(nèi)皮細胞的體外成管實驗將cAVM和STV組內(nèi)皮細胞行體外成管實驗。結(jié)果顯示:cAVM組成管長度明顯低于STV對照組,cAVM組原代培養(yǎng)細胞成管長度為12.58±0.30 mm/mm2,STV組原代培養(yǎng)細胞成管長度為22.42±0.86mm/mm2(P0.05,n=3)。8內(nèi)皮細胞體外遷移力和侵襲力差異表現(xiàn)內(nèi)皮細胞遷移和侵襲實驗中,cAVM內(nèi)皮細胞遷移穿膜細胞數(shù)和侵襲穿膜細胞數(shù)均明顯減少,與STV對照組比較,有顯著的差異(P0.05)。其中cAVM內(nèi)皮細胞遷移個數(shù)為596.50±29.07,STV內(nèi)皮細胞遷移個數(shù)為28.42±8.56。而在細胞侵襲實驗中,可以得出cAVM內(nèi)皮細胞侵襲細胞計數(shù)為375.56±24.49,STV內(nèi)皮細胞侵襲個數(shù)為31.50±3.76。說明cAVM組的內(nèi)皮細胞遷移和侵襲能力均較正常對照組明顯下降。結(jié)論:通過膠原酶消化法及流式細胞學分選行原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)是獲取cAVM內(nèi)皮細胞的有效方法,成功率高,可靠性大,可以構(gòu)建體外研究cAVM血管內(nèi)皮細胞的模型。證實了在cAVM組內(nèi)皮細胞的成管、遷移及侵襲能力明顯降低。因此,內(nèi)皮細胞功能的下降可能是動靜脈畸形血管團形成的機制之一。
【關(guān)鍵詞】：腦動靜脈畸形(cAVM) 顳淺靜脈 原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 流式細胞術(shù) 細胞鑒定
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-21
• 結(jié)果21-23
• 附圖23-30
• 附表30-31
• 討論31-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-38
• 綜述 腦動靜脈畸形分子生物學：當前研究現(xiàn)狀與未來趨勢的回顧38-51
• 參考文獻45-51
• 致謝51-52
• 個人簡歷52

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本文編號：466977