發(fā)布時(shí)間：2024-01-24 10:03

　　目的:構(gòu)建攜帶human-VEGF165基因的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞(OECs),探索將human-VEGF165基因?qū)隣ECs的方法,分析構(gòu)建OECs-VEGF基因工程細(xì)胞的可行性。方法:差速貼壁法純化OECs,采用免疫熒光鑒定OECs原代細(xì)胞純度。使用慢病毒包裝試劑盒,通過三種質(zhì)粒的共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,合成攜帶目的基因的慢病毒載體。熒光實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定病毒滴度,采用免疫熒光檢測(cè)和ELISA檢測(cè)OECs-VEGF165基因工程細(xì)胞。結(jié)果:差速貼壁法所取出的原代細(xì)胞約在所有細(xì)胞中占98%,第二代約占78%,第三代降至58%,活性也明顯下降,細(xì)胞形態(tài)變得多種多樣,增殖變緩。從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的293T細(xì)胞提取的蛋白中檢測(cè)到22KD附近處有條帶,其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合。合成病毒的滴度為2×10⁸個(gè)/ml。轉(zhuǎn)染組GFP陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例大于80%,轉(zhuǎn)染后MOI為5亞組細(xì)胞死亡較少,細(xì)胞功能恢復(fù)快。轉(zhuǎn)染成功的OECs觀察到外源VEGFA的表達(dá)。結(jié)論:差速貼壁法純化是簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的體外研究OECs的方法,要選擇合適的傳代次數(shù)。通過攜帶有human...

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