目的:腦膠質(zhì)瘤是人腦部最常見及原發(fā)性的惡性腫瘤,目前治療腦膠質(zhì)瘤的方法是手術(shù)切除,結(jié)合術(shù)后放療和化療。血腫瘤屏障(blood tumor barrier,BTB)極大地限制了大多數(shù)的化療藥物進(jìn)入腫瘤組織中,降低了化療的療效。因此,選擇性開放BTB以增加腦腫瘤組織中的藥物濃度對于提高化學(xué)療法治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效性至關(guān)重要。PIWI(P-element-induced wimpy testis)蛋白屬于Argonaute(AGO)家族,參與癌癥發(fā)生的生物學(xué)過程。PIWI蛋白識別并結(jié)合PIWI相互作用RNA(piRNA),構(gòu)成piRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(piRISC),在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)座子沉默等發(fā)揮重要的作用。PIWIL1(Piwi‐like RNA‐mediated gene silencing 1)是PIWI蛋白家族中的一員,能促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和抑制其凋亡。然而,PIWIL1在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及功能,目前尚未見報(bào)道。PiRNAs(Piwi-interacting RNA)是長度為23-32個(gè)核苷酸(nt)的非編碼RNA。最近研究表明,piRNAs在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程...

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :PIWIL1/pi RNA-DQ593109 通過MEG3/mi R-330-5p/RUNX3 軸調(diào)控血腫瘤屏障通透性的機(jī)制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株
            2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            2.1.3 主要的實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 細(xì)胞換液、傳代
            2.2.3 細(xì)胞凍存
            2.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.2.5 體外血腫瘤屏障模型的建立
            2.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測PIWIL1 m RNA、pi RNA-DQ593109、MEG3、mi R-330-5p和 RUNX3 m RNA的表達(dá)變化
                2.2.6.1 細(xì)胞總RNA提取
                2.2.6.2 基因組去除DNA反應(yīng)
                2.2.6.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
                2.2.6.4 PCR反應(yīng)
                2.2.6.5 探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測pi RNA-DQ593109 及miR-330-5p的表達(dá)
            2.2.7 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
                2.2.7.1 沉默PIWIL1質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
                2.2.7.2 piR-DQ593109沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
                2.2.7.3 miR-330-5p過表達(dá)和沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
                2.2.7.4 MEG3質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
                2.2.7.5 RUNX3過表達(dá)和沉默質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
                2.2.7.6 PIWIL1與pi R-DQ593109與MEG3 共轉(zhuǎn)染
                2.2.7.7 MEG3與mi R-330-5p共轉(zhuǎn)染
                2.2.7.8 mi R-330-5p與 RUNX3 共轉(zhuǎn)染
            2.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測
                2.2.8.1 明確MEG3與pi R-DQ593109 的結(jié)合作用及結(jié)合位點(diǎn)
                2.2.8.2 明確MEG3與mi R-330-5p結(jié)合作用及結(jié)合位點(diǎn)
                2.2.8.3 明確RUNX33’-UTR與 mi R-330-5p結(jié)合作用及結(jié)合位點(diǎn)
            2.2.9 跨內(nèi)皮阻抗值(TEER)檢測
            2.2.10 辣根過氧化(HRP)滲出量的檢測
            2.2.11 Western blot
            2.2.12 免疫熒光
            2.2.13 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)
            2.2.14 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)
        2.3 統(tǒng)計(jì)方法
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 在GECs中 PIWIL1 高表達(dá),沉默PIWIL1 的表達(dá)增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.2 在GECs中 pi R-DQ593109 高表達(dá),沉默pi R-DQ593109 的表達(dá)增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.3 在GECs中 MEG3 低表達(dá),過表達(dá)MEG3 增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.4 PIWIL1/ pi R-DQ593109 復(fù)合物以序列特定的方式調(diào)節(jié)MEG3 的表達(dá)
        3.5 MEG3 靶向結(jié)合并負(fù)性調(diào)控mi R-330-5p的表達(dá)
        3.6 在GECs中 mi R-330-5p高表達(dá),沉默mi R-330-5p的表達(dá)增加BTB的通透性
        3.7 mi R-330-5p介導(dǎo)MEG3對BTB通透性的調(diào)控
        3.8 mi R-330-5p靶向結(jié)合RUNX
        3.9 RUNX3在GECs中低表達(dá),過表達(dá)RUNX3 增加BTB通透性,并在轉(zhuǎn)錄水平抑制ZO-1,occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.10 RUNX3 參與mi R-330-5p對 BTB通透性的調(diào)控
        3.11 RUNX3 顯著降低ZO-1,occludin和 claudin-5 啟動子的活性
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 :RBFOX1 介導(dǎo)LINC00673 通過SMD途徑降解MAFF m RNA調(diào)控血腫瘤屏障通透性的機(jī)制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和組織樣本
            2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇
            2.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q RT-PCR)
            2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RBFOX1、LINC00673、MAFF過表達(dá)與表達(dá)沉默的細(xì)胞系及分組
            2.2.4 跨內(nèi)皮電阻值(TEER)
            2.2.5 辣根過氧化物酶(HRP)
            2.2.6 western blot
            2.2.7 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)
            2.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析
            2.2.9 細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)
            2.2.10 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)
            2.2.11 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
            2.2.12 Click-i T Nasent RNA Capture Kit方法捕獲新合成RNA
        2.3 統(tǒng)計(jì)方法
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 RBFOX1在GECs中低表達(dá),過表達(dá)RBFOX1 增加BTB的通透性并且降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.2 LINC00673在GECs中高表達(dá),沉默LINC00673 增加BTB的通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.3 在GECs中 RBFOX1 靶向結(jié)合LINC00673,降低LINC00673 的穩(wěn)定性,并且LINC00673 介導(dǎo)RBFOX1 調(diào)控BTB的通透性。
        3.4 MAFF是 LINC00673 的下游靶基因,LINC00673 通過Staufen1(STAU1)介導(dǎo)的m RNA降解(SMD)方式下調(diào)MAFF的表達(dá)
        3.5 MAFF介導(dǎo)LINC00673 調(diào)控BTB的通透性
        3.6 MAFF在 GECs中低表達(dá),過表達(dá)MAFF增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表達(dá)
        3.7 MAFF結(jié)合緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5 啟動子區(qū)并降低其活性
        3.8 過表達(dá)RBFOX1 聯(lián)合沉默LINC00673 能夠促進(jìn)阿霉素通過BTB輸送到腫瘤組織中,促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的凋亡
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡介



本文編號：3842377