目的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病是以神經系統(tǒng)中特定的神經元損傷、丟失為主要病理特征的疾病。細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,涉及突觸可塑性、行為和認知。在神經退行性疾病病理狀態(tài)下Cdk5過渡活化導致突觸密度降低的同時增加β淀粉樣蛋白(Aβ)生成,隨后在大腦中導致持續(xù)的神經退行性病變。次級運動皮層(M2)在以運動異常為特征的神經退行性疾病中發(fā)揮重要作用。CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)可以準確、高效地編輯高等生物的細胞基因組DNA,因此在各種人類疾病的基因治療中展現(xiàn)出廣闊的應用前景。本課題構建一個CRISPR/Cas-Cdk5基因組編輯系統(tǒng),基于次級運動皮層(M2)區(qū)Cdk5基因的表達調控,在正常小鼠率先作了初步有效性研究以及作用機制探討,研究Cdk5對次級運動皮層(M2)神經環(huán)路調控及運動功能特異性調控作用,為對后續(xù)神經退行性疾病的治療研究奠定基礎。方法1.Cdk5-sgRNA慢病毒載體的設計及體內體外表達驗證設計了三對不同的sgRNA序列,并使用CRISPR-Cas9基因編輯策略進行了合成。并將它們分別載入慢病毒載體GV393的相應表達框內,從而構建出針對Cd...

【文章頁數】：94 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
符號說明
前言
第一部分 :CRISPR-Cas9介導的Cdk5基因敲除慢病毒表達載體的構建及驗證
    1.實驗材料
    2.試驗方法
        2.1 主要試劑配制
        2.2 CRISPR-Cas9編輯Cdk5基因敲除sgRNA設計及載體合成
            2.2.1 sgRNA序列設計
            2.2.2 慢病毒載體的選擇
            2.2.3 病毒合成及滴度測定
        2.3 HEK293-T細胞體外活性篩選驗證
            2.3.1 HEK293-T細胞分盤
            2.3.2 轉染前換液
            2.3.3 轉染
            2.3.4 觀察感染效率
        2.4 體內M2區(qū)立體定位注射表達驗證
            2.4.1 實驗流程
            2.4.2 慢病毒次級運動皮層(M2)腦立體定位注射
            2.4.3 免疫組化驗證
            2.4.4 Western blot檢測轉染細胞表達情況
        2.5 統(tǒng)計分析方法
    3.結果
        1.Cdk5-sgRNA序列設計結果
        2.CRISPR-Cas9介導的Cdk5基因敲除慢病毒表達載體體外初篩結果
        3.CRISPR-Cas9介導的Cdk5基因敲除慢病毒表達載體M2區(qū)表達結果
        4.CRISPR-Cas9介導的Cdk5基因敲除慢病毒載體M2區(qū)表達降低了Cdk5蛋白濃度
    4.小結
第二部分 :M2區(qū)神經元Cdk5缺失對小鼠運動調控作用及機制研究
    1.實驗材料
    2.試驗方法
        2.1 行為學檢測
            2.1.1 自發(fā)活動行為檢測
            2.1.2 轉棒實驗
        2.2 神經元高爾基染色
        2.3 PSD-95免疫熒光染色
        2.4 膜片鉗系統(tǒng)記錄興奮性突觸后電流
        2.5 次級運動皮層逆行投射強度示蹤
        2.6 統(tǒng)計分析
    3.結果
        3.1 M2區(qū)Cdk5缺失后小鼠運動能力受損
        3.2 M2區(qū)V層錐體神經元Cdk5基因缺失后樹突長度和脊柱密度降低
        3.3 Cdk5缺乏會影響M2區(qū)神經元的基礎突觸傳遞功能
        3.4 M2區(qū)Cdk5缺乏降低該區(qū)域向丘腦,前額葉皮質和屏狀核的信號投射強度
    4.小結
討論
全文結論與展望
參考文獻
綜述
    綜述參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
個人簡歷
開題、中期及學位論文答辯委員組成



本文編號：3839503