目的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是以神經(jīng)系統(tǒng)中特定的神經(jīng)元損傷、丟失為主要病理特征的疾病。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,涉及突觸可塑性、行為和認(rèn)知。在神經(jīng)退行性疾病病理狀態(tài)下Cdk5過(guò)渡活化導(dǎo)致突觸密度降低的同時(shí)增加β淀粉樣蛋白(Aβ)生成,隨后在大腦中導(dǎo)致持續(xù)的神經(jīng)退行性病變。次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M2)在以運(yùn)動(dòng)異常為特征的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)可以準(zhǔn)確、高效地編輯高等生物的細(xì)胞基因組DNA,因此在各種人類疾病的基因治療中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本課題構(gòu)建一個(gè)CRISPR/Cas-Cdk5基因組編輯系統(tǒng),基于次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M2)區(qū)Cdk5基因的表達(dá)調(diào)控,在正常小鼠率先作了初步有效性研究以及作用機(jī)制探討,研究Cdk5對(duì)次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M2)神經(jīng)環(huán)路調(diào)控及運(yùn)動(dòng)功能特異性調(diào)控作用,為對(duì)后續(xù)神經(jīng)退行性疾病的治療研究奠定基礎(chǔ)。方法1.Cdk5-sgRNA慢病毒載體的設(shè)計(jì)及體內(nèi)體外表達(dá)驗(yàn)證設(shè)計(jì)了三對(duì)不同的sgRNA序列,并使用CRISPR-Cas9基因編輯策略進(jìn)行了合成。并將它們分別載入慢病毒載體GV393的相應(yīng)表達(dá)框內(nèi),從而構(gòu)建出針對(duì)Cd...

【文章頁(yè)數(shù)】：94 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
符號(hào)說(shuō)明
前言
第一部分 :CRISPR-Cas9介導(dǎo)的Cdk5基因敲除慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證
    1.實(shí)驗(yàn)材料
    2.試驗(yàn)方法
        2.1 主要試劑配制
        2.2 CRISPR-Cas9編輯Cdk5基因敲除sgRNA設(shè)計(jì)及載體合成
            2.2.1 sgRNA序列設(shè)計(jì)
            2.2.2 慢病毒載體的選擇
            2.2.3 病毒合成及滴度測(cè)定
        2.3 HEK293-T細(xì)胞體外活性篩選驗(yàn)證
            2.3.1 HEK293-T細(xì)胞分盤(pán)
            2.3.2 轉(zhuǎn)染前換液
            2.3.3 轉(zhuǎn)染
            2.3.4 觀察感染效率
        2.4 體內(nèi)M2區(qū)立體定位注射表達(dá)驗(yàn)證
            2.4.1 實(shí)驗(yàn)流程
            2.4.2 慢病毒次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M2)腦立體定位注射
            2.4.3 免疫組化驗(yàn)證
            2.4.4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)情況
        2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法
    3.結(jié)果
        1.Cdk5-sgRNA序列設(shè)計(jì)結(jié)果
        2.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的Cdk5基因敲除慢病毒表達(dá)載體體外初篩結(jié)果
        3.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的Cdk5基因敲除慢病毒表達(dá)載體M2區(qū)表達(dá)結(jié)果
        4.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的Cdk5基因敲除慢病毒載體M2區(qū)表達(dá)降低了Cdk5蛋白濃度
    4.小結(jié)
第二部分 :M2區(qū)神經(jīng)元Cdk5缺失對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)調(diào)控作用及機(jī)制研究
    1.實(shí)驗(yàn)材料
    2.試驗(yàn)方法
        2.1 行為學(xué)檢測(cè)
            2.1.1 自發(fā)活動(dòng)行為檢測(cè)
            2.1.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)
        2.2 神經(jīng)元高爾基染色
        2.3 PSD-95免疫熒光染色
        2.4 膜片鉗系統(tǒng)記錄興奮性突觸后電流
        2.5 次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層逆行投射強(qiáng)度示蹤
        2.6 統(tǒng)計(jì)分析
    3.結(jié)果
        3.1 M2區(qū)Cdk5缺失后小鼠運(yùn)動(dòng)能力受損
        3.2 M2區(qū)V層錐體神經(jīng)元Cdk5基因缺失后樹(shù)突長(zhǎng)度和脊柱密度降低
        3.3 Cdk5缺乏會(huì)影響M2區(qū)神經(jīng)元的基礎(chǔ)突觸傳遞功能
        3.4 M2區(qū)Cdk5缺乏降低該區(qū)域向丘腦,前額葉皮質(zhì)和屏狀核的信號(hào)投射強(qiáng)度
    4.小結(jié)
討論
全文結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
個(gè)人簡(jiǎn)歷
開(kāi)題、中期及學(xué)位論文答辯委員組成



本文編號(hào)：3839503