目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種慢性脫髓鞘疾病,多由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)炎癥和自身免疫功能障礙引起,通常導(dǎo)致患者嚴(yán)重的終身殘疾。目前沒(méi)有可以治愈MS的方法,治療主要依靠疾病修飾藥物和對(duì)癥治療藥物,減慢疾病進(jìn)展從而減少疾病復(fù)發(fā)和嚴(yán)重程度。干細(xì)胞治療在臨床研究和多種疾病模型中均被證實(shí)能有效減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷,減緩疾病的進(jìn)展。最近的研究表明,外泌體參與的旁分泌作用可能是干細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的主要途徑,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體在許多自身免疫性疾病和組織損傷中發(fā)揮著治療作用。小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS的免疫監(jiān)視細(xì)胞,其M1/M2表型相互轉(zhuǎn)化的比例失衡,參與MS的發(fā)生發(fā)展,影響疾病進(jìn)程。本研究采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體治療MS動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,探討外泌體治療對(duì)疾病大鼠行為學(xué)評(píng)分和CNS病理改變的影響,以及治療前后脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2兩種表型比例的數(shù)量變化,明確外泌體是否影響小膠質(zhì)細(xì)胞極化進(jìn)而減輕MS的嚴(yán)重...

【文章頁(yè)數(shù)】：111 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
第一部分 :大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體的提取及鑒定
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.1.4 主要工作液配制
        2.2 原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取
            2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材
            2.2.2 原代細(xì)胞接種
            2.2.3 傳代培養(yǎng)
            2.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)
            2.2.5 細(xì)胞凍存
            2.2.6 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.3 大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
            2.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察
            2.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制
            2.3.3 細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定
            2.3.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)
            2.3.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)
            2.3.6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化誘導(dǎo)
        2.4 大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離提取和鑒定
            2.4.1 外泌體的分離提取
            2.4.2 外泌體形態(tài)觀察
            2.4.3 外泌體蛋白濃度測(cè)定
            2.4.4 外泌體表面標(biāo)志物鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
        3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體特性鑒定
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 :骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的治療作用
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
            2.1.4 主要試劑配制
        2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
            2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組
        2.3 實(shí)驗(yàn)方法和步驟
            2.3.1 EAE模型建立
            2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重及行為學(xué)評(píng)分監(jiān)測(cè)
            2.3.3 腦和脊髓組織固定、包埋及切片
            2.3.4 腦和脊髓組織病理染色
            2.3.5 脊髓組織免疫熒光染色
            2.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            2.3.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
            2.3.8 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 構(gòu)建EAE大鼠動(dòng)物模型
        3.2 各組大鼠體重和行為學(xué)改變比較
        3.3 各組大鼠腦和脊髓病理學(xué)改變比較
        3.4 各組大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子分泌情況
        3.5 各組大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分 :骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及初步機(jī)制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和分組
            2.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
            2.2.2 主要試劑配制
            2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.4 實(shí)驗(yàn)分組
        2.3 實(shí)驗(yàn)方法和步驟
            2.3.1 共培養(yǎng)體系構(gòu)建
            2.3.2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2 相關(guān)標(biāo)志物mRNA的水平
            2.3.3 各組小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子分泌情況
            2.3.4 各組小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO水平
            2.3.5 shotgun檢測(cè)
            2.3.6 Label-free檢測(cè)外泌體處理前后小膠質(zhì)細(xì)胞差異蛋白表達(dá)譜
            2.3.7 生物信息學(xué)分析
            2.3.8 PRM驗(yàn)證
            2.3.9 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 NO水平檢測(cè)
        3.2 細(xì)胞因子水平檢測(cè)
        3.3 小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2 表型相關(guān)標(biāo)志物mRNA水平檢測(cè)
        3.4 外泌體功能蛋白表達(dá)譜
        3.5 外泌體處理前后小膠質(zhì)細(xì)胞差異蛋白表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析
        3.6 PRM驗(yàn)證
    4 討論
    5 結(jié)論
本論文創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3817468