GABA能神經(jīng)元是紋狀體中數(shù)量上占比最大的一類神經(jīng)元,作為一種抑制性神經(jīng)元,在成體動物的大腦內(nèi)參與了神經(jīng)再生過程。有文獻(xiàn)報(bào)道,在卒中后小鼠的康復(fù)期內(nèi),抑制紋狀體神經(jīng)元的活性,可以促進(jìn)神經(jīng)再生并改善行為學(xué)功能。然而,GABA能神經(jīng)元在卒中后的亞急性期對小鼠的康復(fù)發(fā)揮著什么樣的作用,且其作用的機(jī)理又是什么,并不清楚。本課題采用光基因的方法并結(jié)合GAD2-Arch-GFP和GAD2-ChR2-tdTomato兩種轉(zhuǎn)基因小鼠,特異性地調(diào)控卒中后紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性,探究其活性對小鼠卒中后的神經(jīng)功能康復(fù)的影響及其作用機(jī)制。1.本課題運(yùn)用GAD2-Arch-GFP和GAD2-ChR2-tdTomato兩種轉(zhuǎn)基因小鼠,用530納米的綠光和473納米的藍(lán)光分別刺激GABA能神經(jīng)元上特異性表達(dá)的光敏感通道蛋白Arch和ChR2,從而實(shí)現(xiàn)對GABA能神經(jīng)元活性的抑制和激活,達(dá)到特異性調(diào)控其活性的目的。為了證明激光確實(shí)可調(diào)控紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性,在第一章中,我們在光刺激的同時,也記錄了神經(jīng)元的電活動。發(fā)現(xiàn)在GAD2-Arch-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中,無論是從局部場電位還是神經(jīng)元的放電頻率,530...

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
緒論
第一章 光基因技術(shù)調(diào)控紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性
    1.1 引言
    1.2 材料與方法
        1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
        1.2.2 電極的制作和埋植
        1.2.3 激光的刺激及神經(jīng)元電活動的記錄
        1.2.4 切片及免疫組化染色
        1.2.5 大腦內(nèi)光刺激范圍測定
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定
        1.3.2 特定波長的激光可調(diào)控紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性
        1.3.3 GABA能神經(jīng)元鑒定
        1.3.4 小鼠腦內(nèi)光刺激體積估算
    1.4 討論
    1.5 本章小結(jié)
第二章 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性促進(jìn)小鼠卒中后的康復(fù)
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        2.2.2 MCAO模型
        2.2.3 神經(jīng)功能評分
        2.2.4 曠場實(shí)驗(yàn)
        2.2.5 犧牲小鼠,取腦切片
        2.2.6 焦油紫染色及腦萎縮體積的測定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性,可促進(jìn)卒中后小鼠神經(jīng)功能的康復(fù)
        2.3.2 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性,可重建卒中后小鼠的運(yùn)動功能
        2.3.3 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性,減少了腦萎縮體積
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管密度的增加
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 免疫熒光染色檢測神經(jīng)再生
        3.2.2 TUNEL染色檢測梗死邊緣區(qū)凋亡細(xì)胞
        3.2.3 CD31染色檢測梗死邊緣區(qū)血管密度
        3.2.4 熒光定量及細(xì)胞計(jì)數(shù)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性增加了SVZ區(qū)Nestin+細(xì)胞的數(shù)量
        3.3.2 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性減少了SVZ區(qū) DCX+細(xì)胞的數(shù)量
        3.3.3 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性減少了梗死邊緣區(qū)DCX+細(xì)胞的數(shù)量
        3.3.4 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性不影響B(tài)rdU+/NeuN+雙陽性細(xì)胞的數(shù)量
        3.3.5 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性減少了梗死邊緣區(qū)TUNEL+細(xì)胞的數(shù)量
        3.3.6 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性增加了梗死邊緣區(qū)的血管密度
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性促進(jìn)卒中后小鼠梗死邊緣區(qū)bFGF的表達(dá)
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要試劑與相關(guān)溶液配制
        4.2.2 腦樣本的收集
        4.2.3 RNA的提取
        4.2.4 Real Time-PCR
        4.2.5 蛋白的提取
        4.2.6 蛋白定量及Western
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性可促進(jìn)bFGF表達(dá)
        4.3.2 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元的活性可促進(jìn)b FGF蛋白水平的表達(dá)
        4.3.3 梗死邊緣區(qū)分泌增多的bFGF主要來源于血管內(nèi)皮
    4.4 討論
    4.5 本章總結(jié)
第五章 抑制紋狀體GABA能神經(jīng)元對OGD細(xì)胞損傷后保護(hù)的體外驗(yàn)證
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 主要試劑與相關(guān)溶液配制
        5.2.2 神經(jīng)元的原代培養(yǎng)
        5.2.3 原代神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)
        5.2.4 原代神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)
        5.2.5 原代神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立
        5.2.6 糖氧剝奪條件下的光刺激
        5.2.7 乳酸脫氫酶試劑盒檢測細(xì)胞活性
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 GAD2-Arch-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠原代神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定
        5.3.2 光刺激下雙細(xì)胞培養(yǎng)體系及三種細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立
        5.3.3 光刺激三種細(xì)胞培養(yǎng)體系后的條件培液可提高OGD條件后細(xì)胞的活性
    5.4 討論
    5.5 本章總結(jié)
全文總結(jié)
研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄1 小鼠神經(jīng)功能14分評分表
附錄2 引物序列
附錄3 中英文縮寫字母表
致謝
攻讀博士期間發(fā)表的論文



本文編號：3767342