目的:神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma,NB）是嬰兒期最常見的惡性實體腫瘤,目前化療耐藥是高危組神經(jīng)母細胞瘤患者的治療難點。研究發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑Perifosine在體內(nèi)、外實驗中均能誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞死亡,并能提高神經(jīng)母細胞瘤細胞對化療藥物的敏感性,且在治療復發(fā)難治性神經(jīng)母細胞瘤的臨床試驗中呈現(xiàn)良好的效果。近年來,多項研究報道Perifosine除抑制Akt活性外,還能夠通過其他作用機制引起細胞死亡。為了深入探索Perifosine新的作用機制,課題組前期在一個神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-AS（AS）細胞中進行的全蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)Perifosine處理后RHO相關(guān)GTP結(jié)合蛋白B（Rho-related GTP-binding protein B,RHOB）表達水平升高。RHOB屬于RHO亞家族,廣泛分布于細胞內(nèi),調(diào)節(jié)細胞骨架、細胞黏附和細胞凋亡等。而RHOB在神經(jīng)母細胞瘤中的作用尚無報道。本研究第一部分旨在探索RHOB在神經(jīng)母細胞瘤中對Perifosine及化療藥物作用的影響。泛素化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾,泛素化蛋白質(zhì)組學是研究蛋白質(zhì)調(diào)控的重要方法,在前期總蛋... 

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分：神經(jīng)母細胞瘤中RHOB不同表達水平對Perifosine或化療藥物作用的影響
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 siRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            2.2.3 藥物處理
            2.2.4 RT-PCR檢測mRNA水平
            2.2.5 Westernblot檢測蛋白水平
            2.2.6 Incucyte變焦活細胞成像系統(tǒng)
            2.2.7 MTS檢測細胞增殖
            2.2.8 流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡
            2.2.9 動物實驗
            2.2.10 免疫組織化學染色
            2.2.11 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 Perifosine處理后神經(jīng)母細胞瘤細胞及腫瘤組織中RHOB的表達水平升高
        3.2 RHOB不同表達水平與神經(jīng)母細胞瘤患者臨床病理相關(guān)性分析
            3.2.1 RHOB在神經(jīng)母細胞起源但分化程度不同的腫瘤中表達水平的比較
            3.2.2 RHOB基因表達水平與神經(jīng)母細胞瘤患者臨床分期相關(guān)性分析
            3.2.3 RHOB基因表達水平與神經(jīng)母細胞瘤患者腫瘤組織中MycN基因狀態(tài)的關(guān)系
            3.2.4 RHOB基因表達水平與神經(jīng)母細胞瘤患者臨床預后的關(guān)系
            3.2.5 在節(jié)細胞神經(jīng)瘤和神經(jīng)母細胞瘤組織標本中,RHOB蛋白表達水平的比較
        3.3 RHOB不同表達水平對AS細胞增殖及存活的影響
            3.3.1 沉默RHOB對AS細胞增殖的影響
            3.3.2 過表達RHOB對AS細胞增殖及存活的影響
        3.4 RHOB不同表達水平對Perifosine作用的影響
            3.4.1 在AS細胞中,沉默RHOB對Perifosine作用的影響
            3.4.2 在AS細胞中,過表達RHOB對Perifosine作用的影響
        3.5 RHOB不同表達水平對AS細胞化療敏感性的影響
            3.5.1 RHOB不同表達水平對AS細胞化療敏感性的影響-依托泊苷(Etoposide)
            3.5.2 RHOB不同表達水平對AS細胞化療敏感性的影響-長春新堿(VCR)
            3.5.3 RHOB不同表達水平對AS細胞化療敏感性的影響-阿霉素(ADR)
            3.5.4 RHOB不同表達水平對AS細胞化療敏感性的影響..順鉑(Cisplatin)
    4 討論
    5 結(jié)論
    參考文獻
第二部分：Perifosine治療神經(jīng)母細胞瘤的泛素化蛋白質(zhì)組學研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 SILAC標記
            2.2.3 蛋白提取
            2.2.4 酶解消化
            2.2.5 HPLC分餾
            2.2.6 親和富集
            2.2.7 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)
            2.2.8 數(shù)據(jù)分析
            2.2.9 生物信息學分析
            2.2.10 免疫共沉淀
            2.2.11 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 Perifosine處理AS細胞后泛素化蛋白質(zhì)組學的定量分析
        3.2 Perifosine處理AS細胞后泛素化蛋白的Motif分析
        3.3 Perifosine處理AS細胞后差異表達的泛素化蛋白分析
            3.3.1 亞細胞結(jié)構(gòu)定位分析
            3.3.2 GO(基因本體)分析
            3.3.3 富集分析
            3.3.4 基于富集分析的聚類分析
        3.4 Perifosine處理AS細胞后HMGCR泛素化水平升高
    4 討論
    5 結(jié)論
    參考文獻
本研究創(chuàng)新性的自我評價
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Akt Inhibitor Perifosine Prevents Epileptogenesis in a Rat Model of Temporal Lobe Epilepsy[J]. Feng Zhu,Jiejing Kai,Linglin Chen,Meiling Wu,Jingyin Dong,Qingmei Wang,Ling-Hui Zeng.  Neuroscience Bulletin. 2018(02)
[2]Role of E3 ubiquitin ligases in lung cancer[J]. Barbara C Snoek,Leonie HAM de Wilt,Gerrit Jansen,Godefridus J Peters.  World Journal of Clinical Oncology. 2013(03)



本文編號：3677389