腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)具有高發(fā)病率、死亡率和致殘率,找到一種切實(shí)有效的治療方式已經(jīng)成為需要急迫解決的問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)作為干細(xì)胞的一種,在腦出血中的治療作用近些年受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注,而其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。神經(jīng)細(xì)胞骨架及軸突的狀態(tài)在腦出血后的神經(jīng)功能損傷和修復(fù)過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用,而亦有研究證明自噬能夠調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞骨架及軸突的修復(fù)。因此,我們推測(cè)ICH后BMSCs治療通過(guò)對(duì)自噬的調(diào)控參與了ICH后軸突和細(xì)胞骨架損傷和修復(fù)過(guò)程。本研究的開(kāi)展可以為臨床ICH后的針對(duì)性治療提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:在大鼠腦出血后給予BMSCs治療,觀察血腫區(qū)神經(jīng)纖維絲200(NF200)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)及自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)變化,并且通過(guò)進(jìn)一步自噬抑制劑3-MA的干預(yù),探索BMSCs和自噬在腦出血后的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。方法:1將10只3周齡SD雄性鼠進(jìn)行BMSCs分離、培養(yǎng):采用體外貼壁法獲取3周齡雄性大鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并分離培養(yǎng),應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行BMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)。2采用4組法將140只SD雌性大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組:(1)Sham組(n=20),(2)ICH組(n=40)(3)ICH+BMSCs組(n=40)(4)ICH+BMSCs+3-MA組(n=40)。ICH、ICH+BMSCs、ICH+BMSCs+3-MA組采用立體定向儀造模,分別輸入自體血100微升、1毫升3-MA和等劑量1×10~7個(gè)/毫升的BMSCs,Sham組不做處理。采用出血后1、3、5、7d做各組檢測(cè),檢測(cè):(1)血腫周圍區(qū)HE染色;(2)含水量采用比重法,(3)免疫組織化學(xué)查看LC3定位;(4)Western-blot檢測(cè)NF200、MAP-2、LC3的蛋白表達(dá);(5)在檢測(cè)認(rèn)知方面,用另外40只鼠腦出血后7~10d做水迷宮實(shí)驗(yàn)。用軟件SPSS21.0對(duì)所得統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,用ANOVA測(cè)定組間差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用P0.05。結(jié)果:1.BMSCs培養(yǎng)與檢測(cè)結(jié)果:傳代培養(yǎng)約11~15d左右,細(xì)胞傳至第3代,細(xì)胞逐漸融合,結(jié)構(gòu)統(tǒng)一。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMSCs表面標(biāo)記物陽(yáng)性率為:CD106為75.63%,CD29為76.47%,CD106和CD29呈陽(yáng)性結(jié)果,CD45為5.39%,CD54為4.61%,CD45和CD54呈陰性表達(dá)。2.HE染色結(jié)果:Sham組大鼠腦組織形態(tài)完整,數(shù)量較多,胞核完整。ICH組腦出血后組織排列不緊密,明顯水腫,毛細(xì)血管擴(kuò)張,胞核缺損。ICH+BMSCs組與ICH組相比,血管間隙增寬,水腫減輕,細(xì)胞數(shù)量顯著回升,有相對(duì)完整神經(jīng)元形態(tài)。ICH+BMSCs+3-MA組與ICH+BMSCs組相比,形態(tài)、組織細(xì)胞數(shù)量方面不如其數(shù)量多,胞核也相對(duì)少見(jiàn)。3.水迷宮檢測(cè)結(jié)果:與Sham組相比,ICH組大鼠需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能找到目標(biāo)象限(P0.05)。和ICH組相比,在出血后7~10天ICH+BMSCs組大鼠找到目標(biāo)平臺(tái)所需時(shí)間更短(P0.05);相比于ICH+BMSCs組,在出血后7~10天ICH+BMSCs+3-MA組找到平臺(tái)的時(shí)間延長(zhǎng)(P0.05)。4.腦組織含水量:Sham組1、3、5、7d的含水量沒(méi)有差別且含水量比較低。ICH組腦組織含水量從第1天開(kāi)始增高,到第3天達(dá)到最高值,然后開(kāi)始下降,而且在各時(shí)間點(diǎn)均比Sham組含水量高。ICH+BMSCs組的含水量與ICH組有相同的走勢(shì),在1~7d水平更低(P0.05)。和ICH+BMSCs組相比,ICH+BMSCs+3-MA組具有相似的變化趨勢(shì),且在1~7d含水量更高(P0.05)。5.MAP-2的蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果:MAP-2在假手術(shù)組組間相近,表達(dá)較強(qiáng)。ICH組MAP-2的蛋白表達(dá)量在出血后1d開(kāi)始下降(P0.05),在3d降到最低,然后開(kāi)始回升,但是在傷后1~7d都低于Sham組(P0.05)。ICH+BMSCs組的MAP-2表達(dá)量和ICH組具有相同的變化趨勢(shì),然而每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都比ICH組高,出血后1~7d差異更明顯(P0.05)。相比于BMSCs組,ICH+BMSCs+3-MA組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化和前者相同,但其含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)更低(P0.05)。6.NF200的蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果:NF200在假手術(shù)組組間相近,表達(dá)較強(qiáng)。ICH組NF200在均明顯的蛋白表達(dá)量在出血后1d開(kāi)始下降(P0.05),在3d降到最低,然后開(kāi)始回升,但是在傷后1~7d都低于Sham組(P0.05)。ICH+BMSCs組的NF200表達(dá)量和ICH組具有相同的變化趨勢(shì),然而每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都比ICH組高,出血后1~7d差異更明顯(P0.05)。相比于BMSCs組,ICH+BMSCs+3-MA組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化和前者相同,但其含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)更低(P0.05)。7.LC3的蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果:Sham組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ組間差別不大,較少陽(yáng)性。和Sham組相比,各時(shí)間ICH組陽(yáng)性程度上升,上升起始于第1天(P0.05),高峰出現(xiàn)于第3天(P0.05),全程陽(yáng)性比Sham組高(P0.05)。ICH+BMSCs組與ICH組全程陽(yáng)性程度更高,(P0.05)。ICH+BMSCs+3-MA組和ICH+BMSCs組相比,變化走向相同,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)而表達(dá)略低(P0.05)。8.LC3免疫組化檢測(cè)結(jié)果:在血腫周圍的皮質(zhì)區(qū)檢測(cè)LC3,Sham組中陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)少見(jiàn);ICH組與Sham組相比,第1天LC3細(xì)胞增多,高峰見(jiàn)于第3天;ICH+BMSCs組與ICH組變化相同,效果更強(qiáng)(P0.05);ICH+BMSCs+3-MA組比ICH+BMSCs組陽(yáng)性減弱,變化趨勢(shì)相似(P0.05)。結(jié)論:在大鼠腦出血后給予BMSCs治療能夠改善大鼠神經(jīng)功能,其分子機(jī)制是通過(guò)激活自噬修復(fù)大鼠受損的神經(jīng)元、軸突及骨架蛋白,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.34
【部分圖文】：

(9) 95%酒精Ⅰ、Ⅱ中各 5min；100 %酒精Ⅰ、Ⅱ中各 10min；(10) 二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各 10min，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。心臟灌注示意圖2.8.3 免疫組化檢測(cè) LC3(1) 烤片：選取 4℃冰箱完整的腦組織切片置于烤箱中，60℃烤 1 h，烤至石蠟成淚滴狀流下；(2) 石蠟切片常規(guī)脫蠟置水，PBS 沖洗 5 min×3 次；(3) 抗原熱修復(fù)。把切片放于枸櫞酸鹽緩沖液中（0.1 mmol/L, p H6.0），微波爐修復(fù)高火（100℃）至沸騰，改為中火（60℃）繼續(xù)加熱 5min，自然冷卻至室溫（約 1 h）后，PBS 沖洗

26 2 CD29、CD45 和 CD54、CD106（BMSCs 表面標(biāo)志物）的細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果g.2 Expression of CD29, CD45 and CD54, CD106（The surface markBMSCs observed by flow cytometry

倒置相差顯微鏡觀察BMSCs培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(400×)
【參考文獻(xiàn)】

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1 安慶祝;毛穎;朱巍;;植入異物法構(gòu)建自發(fā)性腦出血實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2008年50期

本文編號(hào)：2891091