本文關(guān)鍵詞：紅細(xì)胞膜包被聚合物納米疫苗的制備及其對(duì)黑色素瘤的免疫治療研究

  更多相關(guān)文章： 免疫治療 癌癥疫苗 納米顆粒 紅細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞

【摘要】：腫瘤免疫治療是通過激活抗原特異性的免疫應(yīng)答,識(shí)別和殺滅腫瘤細(xì)胞,進(jìn)而避免對(duì)正常細(xì)胞的損害,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,預(yù)防復(fù)發(fā)。目前最廣泛采用的樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗是處理工序復(fù)雜,相應(yīng)的臨床效率較低(7%)。因此,需對(duì)DC疫苗體系進(jìn)行改進(jìn),發(fā)展新型腫瘤疫苗。本研究構(gòu)建一種以紅細(xì)胞膜為基礎(chǔ)的高效的新型還原響應(yīng)多肽納米載體,利用二硫鍵偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)親水性多肽的包封和細(xì)胞內(nèi)快速釋放,結(jié)合紅細(xì)胞促進(jìn)抗原提呈和T細(xì)胞活化的能力,并通過引入DC靶向基團(tuán)和加入佐劑增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。 以羧基端的PLGA為基礎(chǔ),通過三步反應(yīng)合成PLGA-SS-hgp。核磁共振氫譜(1H-NMR)來表征化學(xué)結(jié)構(gòu),多肽的還原響應(yīng)性和包封率則通過將納米粒與還原劑二硫蘇糖醇共孵育,HPLC梯度洗脫測定。采用機(jī)械擠出法制備紅細(xì)胞膜包被的PLGA納米粒(RBC-NP),通過在紅細(xì)胞膜上插入磷脂DSPE-PEG-Man,生成磷脂插入的紅細(xì)胞膜(Man-RBC)。采用TEM確定結(jié)構(gòu),并考察長期穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性,SDS-PAGE分析擠壓前后蛋白的表達(dá),Western blot檢測CD58和CD59的表達(dá)。MTT法比較RBC-NP和Man-RBC-NP的細(xì)胞毒性,并對(duì)RBC-NP和Man-RBC-NP的攝取能力進(jìn)行定性和定量檢測。利用小動(dòng)物活體成像考察體內(nèi)組織分布行為及其對(duì)抗原貯庫的影響。進(jìn)一步觀察甘露糖插入的紅細(xì)胞膜包被的PLGA-SS-hgp納米疫苗(Man-RBC-NPhgp)聯(lián)合佐劑MPLA (M)對(duì)DC細(xì)胞熟化的影響,流式細(xì)胞儀檢測CD86的表達(dá),ELISA法測定炎性細(xì)胞因子的分泌。通過三種不同的動(dòng)物模型(預(yù)防模型、治療模型和肺轉(zhuǎn)移模型)來研究此新型疫苗的抗腫瘤效應(yīng),并探討此納米疫苗的作用機(jī)制。最后,采用化療藥物與腫瘤疫苗相結(jié)合,評(píng)價(jià)二者單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效應(yīng),并分析其可能的機(jī)制。 結(jié)果證明我們成功的合成了PLGA-SS-hgp聚合物,并通過HPLC確認(rèn)了其還原敏感性。TEM顯示RBC-NP具有特征性的核殼結(jié)構(gòu),在PBS和胎牛血清這兩種介質(zhì)中具有良好的穩(wěn)定性。SDS-PAGE顯示Man-RBC-NP和RBC-NP的蛋白表達(dá)和天然紅細(xì)胞膜基本一致,Western blot證明擠出后RBC-NP仍存在CD58和CD59分子。RBC-NP和Man-RBC-NP均可以被DC2.4細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)有效攝取,而毒性實(shí)驗(yàn)顯示其具有良好的生物相容性。Man-RBC-NP組的細(xì)胞攝取明顯增強(qiáng),具有較強(qiáng)的貯庫效應(yīng),皮內(nèi)注射24小時(shí)后主要分布在淋巴結(jié)。此納米疫苗可以增強(qiáng)CD86表達(dá)和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納米疫苗能夠延緩腫瘤出現(xiàn),具有較好的抑制腫瘤和轉(zhuǎn)移的效果,減少腫瘤組織中CD31的表達(dá),降低肺組織中CD31和MMP2的表達(dá),增強(qiáng)免疫小鼠體內(nèi)IgG水平,上調(diào)荷瘤小鼠CTL的比例,促進(jìn)免疫小鼠IFN-γ的分泌。而化療與免疫結(jié)合可顯著抑制腫瘤生長,增加DC和CTL在淋巴結(jié)細(xì)胞的比例,降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)表達(dá),促進(jìn)荷瘤小鼠IFN-γ的分泌。 總之,我們成功合成了還原響應(yīng)性的多肽聚合物偶聯(lián)物,構(gòu)建紅細(xì)胞膜包被的多肽聚合物納米疫苗,具備相對(duì)較低的細(xì)胞毒性,易被抗原提呈細(xì)胞攝取,具有較好的貯庫效應(yīng)并可聚集在淋巴結(jié),能誘導(dǎo)DC熟化,增加細(xì)胞因子分泌,體內(nèi)預(yù)防及抗腫瘤治療實(shí)驗(yàn)證明此納米疫苗具有良好的黑色素瘤的預(yù)防和抗腫瘤及轉(zhuǎn)移效果。 本課題成功設(shè)計(jì)了新型靶向樹突狀細(xì)胞的紅細(xì)胞膜包被聚合物納米疫苗,為探索黑色素瘤新型治療方法提供了一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：免疫治療 癌癥疫苗 納米顆粒 紅細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.5;R730.51
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-21
• 參考文獻(xiàn)18-21
• 第一部分 PLGA-SS-hgp的合成和表征21-33
• 引言21
• 材料和方法21-24
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 結(jié)果24-29
• 1. 核磁共振氫譜分析25-27
• 2. hgp100的標(biāo)準(zhǔn)曲線27-28
• 3. 還原性響應(yīng)實(shí)驗(yàn)28-29
• 討論29-31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 第二部分 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米粒的制備和表征33-44
• 引言33-34
• 材料與方法34-37
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料34
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 結(jié)果37-41
• 1. PLGA NP和RBC-NP的粒徑及形貌比較37
• 2. PLGA NP和RBC-NP的長期穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性37-40
• 3. SDS-PAGE檢測RBC-NP的蛋白表達(dá)40-41
• 討論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-44
• 第三部分 紅細(xì)胞膜包被PLGA納米粒體外攝取和體內(nèi)靶向性研究44-58
• 引言44-45
• 材料與方法45-49
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 2. 試劑配制46
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法46-49
• 結(jié)果49-54
• 1. 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米粒的細(xì)胞攝取49-51
• 2. 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米粒的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)51
• 3. 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米粒的體內(nèi)攝取試驗(yàn)51-52
• 4. 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米粒的抗原貯庫效應(yīng)52-53
• 5. 紅細(xì)胞包被聚合物納米粒在小鼠的體內(nèi)分布研究53-54
• 討論54-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 第四部分 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米疫苗對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的影響58-68
• 引言58
• 材料與方法58-62
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 2. 試劑配制59
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法59-62
• 結(jié)果62-65
• 1. BMDCs培養(yǎng)及光鏡觀察62-63
• 2. 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD86的表達(dá)63
• 3. 納米疫苗對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響63-65
• 討論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-68
• 第五部分 紅細(xì)胞膜包被聚合物納米疫苗對(duì)腫瘤預(yù)防、治療和轉(zhuǎn)移的評(píng)價(jià)68-93
• 引言68-69
• 材料與方法69-73
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料69-70
• 2. 試劑配制70
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法70-73
• 結(jié)果73-87
• 1. 納米疫苗對(duì)黑色素瘤的腫瘤預(yù)防作用73-74
• 2. 納米疫苗對(duì)黑色素瘤的抑制作用74-79
• 3. 納米疫苗對(duì)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用79-84
• 4. 納米疫苗對(duì)免疫小鼠血清中抗hgp100特異性抗體IgG的影響84
• 5. ELISPOT檢測hgp100特異性效應(yīng)T細(xì)胞84-86
• 6. 納米疫苗對(duì)荷瘤小鼠CTL比例的影響86
• 7. 納米疫苗對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的影響86-87
• 討論87-90
• 參考文獻(xiàn)90-93
• 第六部分 化療與免疫治療相結(jié)合治療黑色素瘤的初步探索93-106
• 引言93
• 材料與方法93-96
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料93-94
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法94-96
• 結(jié)果96-102
• 1. 化療與免疫相結(jié)合對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制96-99
• 2. 流式細(xì)胞儀檢測淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞含量99
• 3. 流式細(xì)胞儀檢測荷瘤小鼠淋巴結(jié)CTL表達(dá)99-100
• 4. 荷瘤小鼠脾臟Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)的流式分析100-101
• 5. 荷瘤小鼠效應(yīng)細(xì)胞對(duì)hgp100多肽的抗原特異性反應(yīng)101-102
• 討論102-104
• 參考文獻(xiàn)104-106
• 綜述106-129
• 參考文獻(xiàn)122-129
• 發(fā)表的文章129-130
• 致謝130

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 法祥光;;紅細(xì)胞膜異常[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊;1979年01期

2 潘華珍,張之南;紅細(xì)胞膜與溶血[J];牡丹江醫(yī)專學(xué)報(bào);1982年02期

3 董偉;紅細(xì)胞膜與疾病研究進(jìn)展[J];生理科學(xué);1988年05期

4 肖天慶;紅細(xì)胞膜輸氧作用與紅細(xì)胞變形問題的初探(摘要)[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;1988年03期

5 吳s，

本文編號(hào)：921356