本文關(guān)鍵詞：紅細胞膜包被聚合物納米疫苗的制備及其對黑色素瘤的免疫治療研究

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【摘要】：腫瘤免疫治療是通過激活抗原特異性的免疫應(yīng)答,識別和殺滅腫瘤細胞,進而避免對正常細胞的損害,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,預(yù)防復(fù)發(fā)。目前最廣泛采用的樹突狀細胞(DC)疫苗是處理工序復(fù)雜,相應(yīng)的臨床效率較低(7%)。因此,需對DC疫苗體系進行改進,發(fā)展新型腫瘤疫苗。本研究構(gòu)建一種以紅細胞膜為基礎(chǔ)的高效的新型還原響應(yīng)多肽納米載體,利用二硫鍵偶聯(lián)實現(xiàn)親水性多肽的包封和細胞內(nèi)快速釋放,結(jié)合紅細胞促進抗原提呈和T細胞活化的能力,并通過引入DC靶向基團和加入佐劑增強機體的免疫應(yīng)答。 以羧基端的PLGA為基礎(chǔ),通過三步反應(yīng)合成PLGA-SS-hgp。核磁共振氫譜(1H-NMR)來表征化學(xué)結(jié)構(gòu),多肽的還原響應(yīng)性和包封率則通過將納米粒與還原劑二硫蘇糖醇共孵育,HPLC梯度洗脫測定。采用機械擠出法制備紅細胞膜包被的PLGA納米粒(RBC-NP),通過在紅細胞膜上插入磷脂DSPE-PEG-Man,生成磷脂插入的紅細胞膜(Man-RBC)。采用TEM確定結(jié)構(gòu),并考察長期穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性,SDS-PAGE分析擠壓前后蛋白的表達,Western blot檢測CD58和CD59的表達。MTT法比較RBC-NP和Man-RBC-NP的細胞毒性,并對RBC-NP和Man-RBC-NP的攝取能力進行定性和定量檢測。利用小動物活體成像考察體內(nèi)組織分布行為及其對抗原貯庫的影響。進一步觀察甘露糖插入的紅細胞膜包被的PLGA-SS-hgp納米疫苗(Man-RBC-NPhgp)聯(lián)合佐劑MPLA (M)對DC細胞熟化的影響,流式細胞儀檢測CD86的表達,ELISA法測定炎性細胞因子的分泌。通過三種不同的動物模型(預(yù)防模型、治療模型和肺轉(zhuǎn)移模型)來研究此新型疫苗的抗腫瘤效應(yīng),并探討此納米疫苗的作用機制。最后,采用化療藥物與腫瘤疫苗相結(jié)合,評價二者單獨及聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效應(yīng),并分析其可能的機制。 結(jié)果證明我們成功的合成了PLGA-SS-hgp聚合物,并通過HPLC確認了其還原敏感性。TEM顯示RBC-NP具有特征性的核殼結(jié)構(gòu),在PBS和胎牛血清這兩種介質(zhì)中具有良好的穩(wěn)定性。SDS-PAGE顯示Man-RBC-NP和RBC-NP的蛋白表達和天然紅細胞膜基本一致,Western blot證明擠出后RBC-NP仍存在CD58和CD59分子。RBC-NP和Man-RBC-NP均可以被DC2.4細胞和抗原提呈細胞(樹突狀細胞和巨噬細胞)有效攝取,而毒性實驗顯示其具有良好的生物相容性。Man-RBC-NP組的細胞攝取明顯增強,具有較強的貯庫效應(yīng),皮內(nèi)注射24小時后主要分布在淋巴結(jié)。此納米疫苗可以增強CD86表達和相關(guān)細胞因子的分泌。動物實驗發(fā)現(xiàn)納米疫苗能夠延緩腫瘤出現(xiàn),具有較好的抑制腫瘤和轉(zhuǎn)移的效果,減少腫瘤組織中CD31的表達,降低肺組織中CD31和MMP2的表達,增強免疫小鼠體內(nèi)IgG水平,上調(diào)荷瘤小鼠CTL的比例,促進免疫小鼠IFN-γ的分泌。而化療與免疫結(jié)合可顯著抑制腫瘤生長,增加DC和CTL在淋巴結(jié)細胞的比例,降低調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+)表達,促進荷瘤小鼠IFN-γ的分泌。 總之,我們成功合成了還原響應(yīng)性的多肽聚合物偶聯(lián)物,構(gòu)建紅細胞膜包被的多肽聚合物納米疫苗,具備相對較低的細胞毒性,易被抗原提呈細胞攝取,具有較好的貯庫效應(yīng)并可聚集在淋巴結(jié),能誘導(dǎo)DC熟化,增加細胞因子分泌,體內(nèi)預(yù)防及抗腫瘤治療實驗證明此納米疫苗具有良好的黑色素瘤的預(yù)防和抗腫瘤及轉(zhuǎn)移效果。 本課題成功設(shè)計了新型靶向樹突狀細胞的紅細胞膜包被聚合物納米疫苗,為探索黑色素瘤新型治療方法提供了一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：免疫治療 癌癥疫苗 納米顆粒 紅細胞 樹突狀細胞
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5;R730.51
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-21
• 參考文獻18-21
• 第一部分 PLGA-SS-hgp的合成和表征21-33
• 引言21
• 材料和方法21-24
• 1. 實驗材料21-22
• 2. 實驗方法22-24
• 結(jié)果24-29
• 1. 核磁共振氫譜分析25-27
• 2. hgp100的標(biāo)準(zhǔn)曲線27-28
• 3. 還原性響應(yīng)實驗28-29
• 討論29-31
• 參考文獻31-33
• 第二部分 紅細胞膜包被聚合物納米粒的制備和表征33-44
• 引言33-34
• 材料與方法34-37
• 1. 實驗材料34
• 2. 實驗方法34-37
• 結(jié)果37-41
• 1. PLGA NP和RBC-NP的粒徑及形貌比較37
• 2. PLGA NP和RBC-NP的長期穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性37-40
• 3. SDS-PAGE檢測RBC-NP的蛋白表達40-41
• 討論41-42
• 參考文獻42-44
• 第三部分 紅細胞膜包被PLGA納米粒體外攝取和體內(nèi)靶向性研究44-58
• 引言44-45
• 材料與方法45-49
• 1. 實驗材料45-46
• 2. 試劑配制46
• 3. 實驗方法46-49
• 結(jié)果49-54
• 1. 紅細胞膜包被聚合物納米粒的細胞攝取49-51
• 2. 紅細胞膜包被聚合物納米粒的細胞毒性評價51
• 3. 紅細胞膜包被聚合物納米粒的體內(nèi)攝取試驗51-52
• 4. 紅細胞膜包被聚合物納米粒的抗原貯庫效應(yīng)52-53
• 5. 紅細胞包被聚合物納米粒在小鼠的體內(nèi)分布研究53-54
• 討論54-56
• 參考文獻56-58
• 第四部分 紅細胞膜包被聚合物納米疫苗對樹突狀細胞成熟的影響58-68
• 引言58
• 材料與方法58-62
• 1. 實驗材料58-59
• 2. 試劑配制59
• 3. 實驗方法59-62
• 結(jié)果62-65
• 1. BMDCs培養(yǎng)及光鏡觀察62-63
• 2. 流式細胞儀檢測細胞表面CD86的表達63
• 3. 納米疫苗對DC分泌細胞因子的影響63-65
• 討論65-66
• 參考文獻66-68
• 第五部分 紅細胞膜包被聚合物納米疫苗對腫瘤預(yù)防、治療和轉(zhuǎn)移的評價68-93
• 引言68-69
• 材料與方法69-73
• 1. 實驗材料69-70
• 2. 試劑配制70
• 3. 實驗方法70-73
• 結(jié)果73-87
• 1. 納米疫苗對黑色素瘤的腫瘤預(yù)防作用73-74
• 2. 納米疫苗對黑色素瘤的抑制作用74-79
• 3. 納米疫苗對黑色素瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用79-84
• 4. 納米疫苗對免疫小鼠血清中抗hgp100特異性抗體IgG的影響84
• 5. ELISPOT檢測hgp100特異性效應(yīng)T細胞84-86
• 6. 納米疫苗對荷瘤小鼠CTL比例的影響86
• 7. 納米疫苗對小鼠脾淋巴細胞殺傷活性的影響86-87
• 討論87-90
• 參考文獻90-93
• 第六部分 化療與免疫治療相結(jié)合治療黑色素瘤的初步探索93-106
• 引言93
• 材料與方法93-96
• 1. 實驗材料93-94
• 2. 實驗方法94-96
• 結(jié)果96-102
• 1. 化療與免疫相結(jié)合對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制96-99
• 2. 流式細胞儀檢測淋巴結(jié)樹突狀細胞含量99
• 3. 流式細胞儀檢測荷瘤小鼠淋巴結(jié)CTL表達99-100
• 4. 荷瘤小鼠脾臟Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)的流式分析100-101
• 5. 荷瘤小鼠效應(yīng)細胞對hgp100多肽的抗原特異性反應(yīng)101-102
• 討論102-104
• 參考文獻104-106
• 綜述106-129
• 參考文獻122-129
• 發(fā)表的文章129-130
• 致謝130

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 法祥光;;紅細胞膜異常[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊;1979年01期

2 潘華珍,張之南;紅細胞膜與溶血[J];牡丹江醫(yī)專學(xué)報;1982年02期

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4 肖天慶;紅細胞膜輸氧作用與紅細胞變形問題的初探(摘要)[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;1988年03期

5 吳s，

本文編號：921356