發(fā)布時間：2017-09-26 03:24

  本文關(guān)鍵詞：熱處理在UVB誘導的人黑素細胞損傷中的作用及其分子機制研究

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【摘要】：白癜風是一種獲得性、多因性、脫色性疾病,主要特征為表皮功能性黑素細胞(MC)進行性消失導致的白色皮損。應(yīng)用波長在290-320 nm的紫外線(UVB)進行光療,是目前白癜風最為廣泛和有效的治療手段。表皮的角質(zhì)形成細胞(KC)和MC可吸收UVB,并誘發(fā)多種生物效應(yīng),最終促使皮損復色。除了治療作用,UVB的副作用也不容忽視,高劑量的UVB輻射可以誘導氧化應(yīng)激、DNA變異等損傷作用,最終導致皮膚老化和皮膚腫瘤。在白癜風患者中,廣泛存在抗氧化系統(tǒng)缺陷,高劑量的UVB可以加速MC的氧化應(yīng)激反應(yīng),降低治療效果。研究發(fā)現(xiàn),熱處理(42℃,1h)可刺激MC增殖,增強黑色素合成,對白癜風具有治療作用。熱處理還可以通過上調(diào)熱休克蛋白(HSP),增加細胞對多種刺激的耐受力,進而提示,熱處理可能在促進色素恢復的同時,降低UVB誘導的各種細胞損傷。目的:觀察熱處理在UVB誘導的MC損傷中的作用,研究熱處理對誘導型Hsp70分布和表達的影響,初步探索Hsp70保護MC對抗UVB損傷的分子機制。方法:從人包皮獲得原代MC,在3-4次傳代后MC純化。將細胞分為四組:對照組(37℃正常培養(yǎng))、熱處理組(42℃,1h)、UVB組(100mJ/cm2 UVB輻射)、聯(lián)合組(熱處理后照射100mJ/cm2 UVB),所有組連續(xù)干預(yù)3d。應(yīng)用MTT法檢測細胞活率,應(yīng)用流式細胞儀(fcm)檢測細胞凋亡率,應(yīng)用生物化學方法檢測總超氧化物歧化酶(sod)活力和丙二醛(mda)水平,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)活性氧(ros)水平,并通過fcm測量細胞內(nèi)ros,應(yīng)用real-timepcr檢測mnsodmrna表達水平。為了進一步探索熱處理后hsp70水平與uvb損傷之間的關(guān)系,分別在熱處理后0h,2h,4h,6h,8h,10,12h給予500mj/cm2uvb輻射,應(yīng)用westernblot檢測不同時間點hsp70表達水平,同時應(yīng)用彗星實驗檢測該時間dna的損傷情況。應(yīng)用hsp70特異性的sirna轉(zhuǎn)染mc,沉默hsp70的表達,進一步驗證hsp70對抗uvb損傷的作用。應(yīng)用免疫熒光染色,觀察hsp70在熱處理或uvb輻射后的分布情況,探索hsp分布與dna損傷間的關(guān)系。結(jié)果:1、mc暴露于高劑量uvb輻射(100mj/cm2)后,可顯著增加細胞dna的損傷(p0.001),降低mnsodmrna水平(p0.01)和總sod活力(p0.01);細胞內(nèi)ros(p0.001)和mda(p0.001)水平增加;最終增加細胞凋亡(p0.001),降低mc活率(p0.001)。2、熱處理后再照射uvb,可以顯著降低uvb誘導的dna損傷(p0.05)和凋亡率(p0.001);與uvb組相比,聯(lián)合處理可增加mnsodmrna的表達(p0.05),提高總sod活力(p0.01),降低mda(p0.001)和ros(p0.001)水平,最終增加mc的活率(p0.001)。3、hsp70的表達水平和dna的損傷程度呈負相關(guān)(r=-0.971,p0.001),而且hsp70特異性sirna可以沉默hsp70的表達,并且消除hsp70對uvb損傷的保護作用(p0.1)。4、即使在hsp70表達水平不增高的情況下,熱處理刺激hsp70向細胞核和核仁轉(zhuǎn)位,也可以減少dna損傷(p0.05);高劑量的atp(400μm)可以抑制hsp70向細胞核轉(zhuǎn)位,進而消除熱處理對細胞dna的保護作用(p0.1)結(jié)論:本實驗顯示,預(yù)先熱處理的mc可以通過刺激hsp70的分布和表達,減輕uvb對dna的損傷作用,維持mnsod等抗氧化酶的表達,對抗氧化應(yīng)激損傷,減少細胞凋亡,提高mc對uvb的耐受。研究證實,熱處理聯(lián)合uvb局部照射治療白癜風,可以減少uvb誘導的多種損傷,具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：熱處理 UVB 黑素細胞 氧化應(yīng)激 Hsp70
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R758.41
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-22
• 1. 白癜風和氧化應(yīng)激13-18
• 2. 熱休克蛋白 70（Hsp70）在應(yīng)激性損傷中的作用18-22
• 實驗一 熱處理在UVB誘導的人黑素細胞損傷中的作用22-35
• 1 材料22-23
• 2 方法23-29
• 3 結(jié)果29-32
• 4 討論32-35
• 實驗二 熱處理對UVB誘導黑素細胞損傷保護機制的研究35-52
• 1 材料35-39
• 2 方法39-42
• 3 結(jié)果42-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻53-64
• 個人簡歷和研究成果64-65
• 致謝65

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