本文關(guān)鍵詞：白念珠菌分泌的誘導(dǎo)人單核細(xì)胞凋亡新因子的初步純化和鑒定

  更多相關(guān)文章： 白念珠菌 THP-1細(xì)胞 SIIF 細(xì)胞增殖 抗真菌感染

【摘要】：目的：本研究我們將觀察從白念珠菌培養(yǎng)上清液中分離到的一種新型毒力因子分泌型IL-12抑制因子（Secretary IL-12Inhibitory Factor，SIIF）對人類單核細(xì)胞增殖率的影響和誘導(dǎo)凋亡情況，檢測其誘導(dǎo)凋亡活性。觀察SIIF蛋白結(jié)合于人類單核細(xì)胞的部位。明確SIIF的蛋白序列和基因序列，篩選出可疑蛋白，有助于后期SIIF蛋白作用機(jī)制的研究及將來有可能采取特異性干擾SIIF蛋白活性的治療方案來控制局部及系統(tǒng)性的白念珠菌感染。方法：白念珠菌菌株選自前期試驗(yàn)中收集念珠菌性陰道炎（vulvovaginal candidiasis, VVC）患者陰道分泌物經(jīng)直接鏡檢、接種培養(yǎng)形態(tài)學(xué)鑒定及提取DNA檢索基因組數(shù)據(jù)庫均鑒定為白念珠菌的菌株。人類單核細(xì)胞選用人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（The Human acutemonocytic leukemia cell line, THP-1）。將選定的白念珠菌接種于含有20mlRPMI1640培養(yǎng)液的離心管中，置于37度恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)兩次純化后接種于含有500mlRPMI1640液體培養(yǎng)基燒瓶中，繼續(xù)37度恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)后收集培養(yǎng)上清液，分裝入離心管中離心除去白念珠菌，，離心后的上清液經(jīng)除菌濾過器（0.22μm）再次除菌，將培養(yǎng)上清液加入Centricon-70蛋白濃縮器（截留分子量大于30KDa的蛋白分子）中離心濃縮得到SIIF蛋白，BCA法測定蛋白濃度后-80度保存?zhèn)溆�。�?shí)驗(yàn)根據(jù)是否在培養(yǎng)的人單核細(xì)胞中加入SIIF蛋白分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組SIIF蛋白終濃度為400μg/ml。SIIF蛋白與THP-1細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后GENMED XTT法分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組450nm波長處吸光度值并根據(jù)吸光度值計算出實(shí)驗(yàn)組相對對照組細(xì)胞增殖率；AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM）分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組THP-1細(xì)胞早期凋亡率；ConA-FITC/DAPI雙染法熒光顯微鏡觀察SIIF蛋白結(jié)合于細(xì)胞部位；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離純化SIIF蛋白，電泳后的SDS-PAGE條帶經(jīng)胰蛋白酶酶解后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem massspectrometric，LC-MS/MS）分析，然后采用Mascot軟件檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫獲得與肽段匹配的相關(guān)蛋白及其基因序列，最后根據(jù)蛋白分子量大小、評分及相關(guān)功能綜合評價篩選出可疑蛋白。測得的THP-1細(xì)胞增殖率及細(xì)胞早期凋亡率應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果：1.GENMEDXTT法檢測顯示SIIF蛋白作用于THP-1細(xì)胞24小時后，450nm處吸光度值明顯低于對照組，實(shí)驗(yàn)組相對對照組細(xì)胞增殖率也明顯低于對照組，與對照組細(xì)胞增殖率相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0260.05）。2.AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測顯示SIIF蛋白作用于THP-1細(xì)胞24小時后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率為（11.867±1.604）%，明顯高于對照組（5.300±0.265）%，與對照組早期凋亡率相比較差異具有顯著性意義（P=0.0020.01）。3.ConA-FITC/DAPI雙染熒光顯微鏡觀察顯示，SIIF蛋白所在位置的綠色熒光與DAPI所在細(xì)胞核位置的藍(lán)色熒光完全重合，說明SIIF蛋白進(jìn)入THP-1細(xì)胞后結(jié)合于細(xì)胞核。4.SIIF蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離、胰蛋白酶酶解及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析后，根據(jù)蛋白分子量大小、評分及功能綜合評價后，我們將分泌型天冬氨酸蛋白酶6（Secretedaspartyl proteinase，Sap6）和Rbt4p（repressed by TUP1protein4）兩種蛋白作為SIIF候選蛋白。結(jié)論：1.SIIF蛋白能抑制THP-1細(xì)胞增殖。2.SIIF蛋白具有誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的活性。3.SIIF蛋白進(jìn)入THP-1后結(jié)合于細(xì)胞核，可能通過影響細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄，功能蛋白合成受阻，使細(xì)胞活性下降，最終細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.Sap6和Rbt4p為候選的SIIF蛋白。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 THP-1細(xì)胞 SIIF 細(xì)胞增殖 抗真菌感染
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R756
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 材料與方法15-27
• 結(jié)果27-36
• 討論36-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 英漢縮略詞對照表46-48
• 致謝48-49
• 抗系統(tǒng)性白念珠菌感染的先天性免疫（綜述）49-61
• 參考文獻(xiàn)57-61

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 邵先安;;淋巴細(xì)胞對白念珠菌的粘附[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);2002年04期

2 張軍民,王漢平,魯長明,席麗艷,曾凡欽;白念珠菌基因微衛(wèi)星多態(tài)性與分型探討[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2002年01期

3 苑天紅,王明永,吳升偉,吳承龍;小鼠腹腔吞噬細(xì)胞對二相性白念珠菌的吞噬研究[J];貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年04期

4 苑天紅,王明永,吳升偉,吳承龍;甘露糖在介導(dǎo)二相性白念珠菌粘附中的重要作用[J];中國人獸共患病雜志;2004年11期

5 苑天紅,王明永,吳升偉,王正蓉,吳承龍;白念珠菌二相性與毒力關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2004年10期

6 李豐霞,張宏,巢和安,謝明;氟康唑聯(lián)合乙醇抗白念珠菌活性的體外實(shí)驗(yàn)研究[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2005年10期

7 朱利平,章強(qiáng)強(qiáng),龔華斐,李莉,翁心華,王家俊,張永信;都柏林念珠菌和白念珠菌分子指紋圖譜差異性分析[J];中華傳染病雜志;2005年04期

8 苑天紅,王明永,吳升偉,王正蓉,吳承龍;白念珠菌二相性與致病性關(guān)系[J];中國公共衛(wèi)生;2005年01期

9 馬黎;席麗艷;;都柏林念珠菌和白念珠菌的致病性比較研究進(jìn)展[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2006年02期

10 黃杉;曹穎瑛;姜遠(yuǎn)英;;白念珠菌基因中斷技術(shù)研究進(jìn)展[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王冬云;譚升順;馬慧群;馬韻琴;陳慶秀;;白念珠菌的毒力研究——分泌性酸性蛋白酶活力的測定[A];2001年中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

2 滿旭;王惠平;;白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)與氟康唑耐藥的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會第十八次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2012年

3 黃廣華;;白念珠菌有性生殖、形態(tài)發(fā)生及毒性的進(jìn)化[A];中國菌物學(xué)會第五屆會員代表大會暨2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

4 王慧;徐寧;喻其林;程欣欣;邢來君;李明春;;鈣細(xì)胞存活途徑與白念珠菌的致病性[A];中國菌物學(xué)會第五屆會員代表大會暨2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

5 閻瀾;李妙海;曹永兵;高平揮;王彥;姜遠(yuǎn)英;;白念珠菌耐藥新蛋白——交替氧化酶[A];藥學(xué)發(fā)展前沿論壇及藥理學(xué)博士論壇論文集[C];2008年

6 郭仁勇;;白念珠菌聚苯乙烯黏附增強(qiáng)基因1的研究進(jìn)展[A];2008年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

7 ;線粒體功能在不同環(huán)境對白念珠菌生存及代謝的影響[A];2012年中國菌物學(xué)會學(xué)術(shù)年會會議摘要[C];2012年

8 曾躍斌;;白念珠菌全基因組表達(dá)譜芯片在抗真菌藥物研究中的應(yīng)用[A];中國藥理學(xué)會第十一屆全國化療藥理學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

9 周萬青;沈瀚;張之烽;張葵;;白念珠菌臨床分離調(diào)查及基因分型研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

10 景偉芳;王惠平;;白念珠菌對唑類藥物耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 國虹 雨凈;微生物的是是非非[N];中國教育報;2001年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉澤虎;白念珠菌形態(tài)、胞壁多糖的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性的相關(guān)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

2 唐寧楓;白念珠菌烯醇化酶的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2000年

3 王平;陰道念珠菌菌種及香蓮方逆轉(zhuǎn)白念珠菌耐藥基因組學(xué)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

4 許懿;小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌的作用機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 李彩霞;陰道細(xì)菌群落多樣性及外陰陰道念珠菌病相關(guān)白念珠菌基因多態(tài)性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

6 王樂;小鼠口腔陰道雙部位白念珠菌感染模型的構(gòu)建及不同部位來源白念珠菌的毒力差異研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

7 曾躍斌;特比萘芬對白念珠菌的藥理作用及誘導(dǎo)耐藥機(jī)制研究[D];汕頭大學(xué);2007年

8 梁曉博;白念珠菌敏感株對氟康唑產(chǎn)生適應(yīng)性突變耐藥的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2000年

9 徐錚;白念珠菌基因芯片的制備和應(yīng)用及兩個新基因的克隆和功能鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 閻瀾;白念珠菌耐藥性產(chǎn)生的“線粒體氧化呼吸抑制”機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉樂;不同培養(yǎng)條件對白念珠菌芽管形成的影響[D];蘭州大學(xué);2008年

2 閻瀾;白念珠菌耐藥株的蛋白質(zhì)組與基因表達(dá)譜分析及差異蛋白質(zhì)與差異基因的識別鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

3 秦曉峰;白念珠菌臨床株耐藥基因表達(dá)與氟康唑耐藥的關(guān)系[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 許懿;小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

5 鐘毅;白念珠菌蘋果酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)及功能初步研究[D];中山大學(xué);2012年

6 張蕾;紫外線對白念珠菌生長的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

7 郭雅莉;白念珠菌多位點(diǎn)序列分型研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

8 滿旭;白念珠菌鋅簇轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)與氟康唑耐藥的關(guān)系[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

9 吳海棠;整合非靶標(biāo)和靶標(biāo)代謝組學(xué)模式的白念珠菌被膜形成及藥物干預(yù)機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 李蕾;白念珠菌天冬氨酸蛋白酶2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

本文編號：846989