發(fā)布時(shí)間：2017-09-14 01:01

  本文關(guān)鍵詞：惡性黑素瘤的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景 惡性黑素瘤是一種高度侵襲和高致死率的惡性腫瘤。多發(fā)生于皮膚,占皮膚惡性腫瘤第三位。也可發(fā)生于眼睛、腸道粘膜和顱內(nèi)等。占皮膚腫瘤死亡人數(shù)的80%。近年來(lái),惡性黑素瘤發(fā)病率每年以4-6%速度上升。早期發(fā)現(xiàn)可手術(shù)切除，但對(duì)已轉(zhuǎn)移病例，目前無(wú)有效治療方法。黑素瘤的形成是一個(gè)多步驟、多因素過(guò)程，包括眾多基因的改變。從基因組和轉(zhuǎn)錄組的水平研究參與這些過(guò)程中的基因變化和基因表達(dá)譜，有助于人們認(rèn)識(shí)黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。既往的研究基于基因芯片或其他腫瘤研究的數(shù)據(jù)，很難發(fā)現(xiàn)對(duì)惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移起特異作用的基因或潛在未發(fā)現(xiàn)的功能基因。因此獲得惡性黑素瘤的完全基因表達(dá)譜尤為重要。 RNA-seq是利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究的高通量方法，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行精確定量分析。我們擬利用RNA-seq的方法對(duì)黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組范圍基因表達(dá)譜的測(cè)序和比較分析。比以前的黑素瘤表達(dá)譜研究，通量大大提高，，基本可以覆蓋所有表達(dá)的基因。因此若比較惡性黑素瘤的轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移組織，可能發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要因素。本研究的 目的:1利用高通量測(cè)序方法（RNA-seq）獲得惡性黑素瘤的基因表達(dá)譜;2建立分析惡性黑素瘤基因差異表達(dá)的數(shù)學(xué)模型;3對(duì)所得基因表達(dá)譜進(jìn)行聚類分析和篩選候選基因；4利用功能試驗(yàn)驗(yàn)證候選基因的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：1利用RNA-seq技術(shù)對(duì)反映黑素瘤不同狀態(tài)的細(xì)胞株：正常黑素細(xì)胞株（HEMn-LP）、低轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤細(xì)胞株（A375）和轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤的胞株（A2058）進(jìn)行深度測(cè)序和基因表達(dá)譜分析；2通過(guò)IDEG6、DAVID、GO、KEGG和IPA等分析方法對(duì)三個(gè)細(xì)胞系所得基因表達(dá)譜進(jìn)行差異分析;3根據(jù)差異基因表達(dá)變化的方式和程度建立9種趨勢(shì)和41種亞趨勢(shì)的數(shù)學(xué)分析模型；4篩選候選基因并在A375中過(guò)表達(dá)候選基因，通過(guò)遷移及穿透試驗(yàn)等驗(yàn)證其生物學(xué)活性。 結(jié)果：1獲得HEMn-LP、A375、A2058三個(gè)細(xì)胞株的基因表達(dá)譜，2基因表達(dá)譜的據(jù)類分析表明腫瘤細(xì)胞株的基因表達(dá)與正常黑素細(xì)胞株顯著差異；3腫瘤細(xì)胞株染色體9、11、12、14的基因表達(dá)與黑素細(xì)胞株差異顯著；4scUscU模式中聚集的基因差異表達(dá)顯著并與惡性黑素瘤生物功能相關(guān)；5候選基因CTGF、Twist1和MAGEA1可提高A375的遷移及穿透力。 結(jié)論：1與惡性黑素瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因大多聚集在染色體9、11、12、14上；2我們建立的9類41種亞趨勢(shì)的數(shù)學(xué)模型可用于篩選與惡性黑素發(fā)生和轉(zhuǎn)移的候選基因；3scUscU中聚集的差異表達(dá)基因大多與惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。4利用上述分析方法篩選的CTGF、Twist1和MAGEA1作為候選基因在A375中過(guò)表達(dá)可明顯提高惡性黑素瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力。
【關(guān)鍵詞】：惡性黑素瘤 腫瘤轉(zhuǎn)移 基因表達(dá)測(cè)序 基因表達(dá)模式
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞11-12
• 第一部分 惡性黑素瘤轉(zhuǎn)錄組研究12-45
• 前言12-15
• 1.方法15-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料15
• 1.2 主要儀器與設(shè)備15-16
• 1.3 主要試劑與耗材16
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法16-23
• 1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)16-18
• 1.4.2 總 RNA 提取18-19
• 1.4.3 mRNA 分離19-20
• 1.4.4 SOLiD 轉(zhuǎn)錄組 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建20-22
• 1.4.5 SOLiD 上機(jī)前準(zhǔn)備22-23
• 1.5 數(shù)據(jù)分析方法23-27
• 1.5.1 SOLiD 測(cè)序序列與基因組對(duì)比23-24
• 1.5.2 構(gòu)建 Junction 數(shù)據(jù)集24
• 1.5.3 基因表達(dá)豐富度的統(tǒng)計(jì)24-25
• 1.5.4 差異表達(dá)基因的鑒定和功能分析25
• 1.5.5 差異表達(dá)基因在染色體上的分布研究25-26
• 1.5.6 差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的構(gòu)建26
• 1.5.7 基因差異表達(dá)數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建26-27
• 2.結(jié)果27-40
• 2.1 mRNA 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建27
• 2.2 RNA-seq 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制研究27-28
• 2.3 RNA-seq 數(shù)據(jù)分析28-30
• 2.4 基因表達(dá)豐度的統(tǒng)計(jì)30-31
• 2.5 A375 和 A2058 細(xì)胞株差異表達(dá)基因的分析31-33
• 2.6 惡性黑素瘤相關(guān)基因的染色體分布特點(diǎn)33-34
• 2.7 與惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路34-36
• 2.8 與惡性黑素瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)模式36-37
• 2.9 鑒別 scUscU, scUscD1 和 scDscU2 的網(wǎng)絡(luò)37-40
• 3. 討論40-44
• 4. 結(jié)論44-45
• 第二部分 惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的研究45-69
• 前言45-47
• 1.材料與方法47-58
• 1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒47
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器47-50
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材47-48
• 1.2.2 試劑盒48-49
• 1.2.3 常用溶液和培養(yǎng)基49
• 1.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器49-50
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法50-58
• 1.3.1 基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建50-52
• 1.3.2 化學(xué)轉(zhuǎn)染(Lipofeactmine 2000)52
• 1.3.3 免疫印跡技術(shù)(Western blot)52-54
• 1.3.4 實(shí)時(shí)定量 PCR (Quantitative Real time PCR)54-56
• 1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)56-57
• 1.3.6. 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)57
• 1.3.7. 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)57-58
• 2. 結(jié)果58-63
• 2.1 與惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選基因的確定58-59
• 2.2 候選基因的 real time-PCR 驗(yàn)證59-60
• 2.3 CTGF、Twist1、MAGEA1 過(guò)表達(dá)可促進(jìn) A375 遷移和侵襲60-63
• 3. 討論63-68
• 4. 結(jié)論68-69
• 文獻(xiàn)綜述69-75
• 參考文獻(xiàn)75-80
• 研究生期間發(fā)表論文80-82
• 致謝82-83

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 陳華江,王杰軍;基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2001年01期

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3 齊菲菲;賀福初;姜穎;;腫瘤轉(zhuǎn)移研究的現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2009年10期

4 牛紀(jì)曉;葉麗亞;婁晉寧;;細(xì)胞粘附分子在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用[J];中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào);2006年02期

5 ;Effect and mechanism of the Twist gene on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells[J];World Journal of Gastroenterology;2008年16期

本文編號(hào)：846932