本文關(guān)鍵詞：整合三維結(jié)構(gòu)的h-CLAT皮膚致敏檢測方法研究

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【摘要】：研究背景皮膚組織是人體阻擋外界物質(zhì)的重要屏障,為人體穩(wěn)態(tài)提供重要保證。其中主要為角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等4種細(xì)胞。人體皮膚作為阻擋外界物質(zhì)干擾的第一道關(guān)卡,會(huì)通過某些特殊反應(yīng)進(jìn)行防御。接觸性過敏性皮炎,是一種由外源物質(zhì)引發(fā)的IV型過敏反應(yīng),是化學(xué)品分類標(biāo)識(shí)、化妝品和皮膚接觸產(chǎn)品毒性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。接觸性過敏性皮炎是皮膚致敏的直接臨床表現(xiàn),人群中有15-20%的皮膚致敏發(fā)生率,而引起這類反應(yīng)的物質(zhì)在生活環(huán)境中隨處可見。因此對(duì)物質(zhì)成分致敏能力的篩查就變得非常重要。豚鼠實(shí)驗(yàn)(例如:豚鼠的最大劑量實(shí)驗(yàn))是最為常用的篩查物質(zhì)致敏性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),目前,優(yōu)化后的小鼠局部淋巴結(jié)實(shí)驗(yàn)(LLNA),以一種早期的預(yù)測工具逐步應(yīng)用在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中。然而,隨著新的歐洲的化妝品法規(guī)(第七次歐洲化妝品指令修訂案)頒布關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在化妝產(chǎn)品中的禁令,某些地區(qū)化妝產(chǎn)品的皮膚致敏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到禁止。如此情勢下,許多非動(dòng)物的皮膚致敏篩查實(shí)驗(yàn)逐步得到開發(fā)利用和法規(guī)認(rèn)可。由于皮膚致敏機(jī)制的復(fù)雜性,同一個(gè)體外測試系統(tǒng)中很難全面反映整個(gè)致敏過程,所以,體外實(shí)驗(yàn)的開發(fā)需要考慮針對(duì)不同的反應(yīng)層次進(jìn)行描述(例如:化學(xué)物質(zhì)的皮膚滲透、蛋白質(zhì)/多肽結(jié)合、特異性抗原免疫反應(yīng)的起始),如此才能夠?qū)Ⅲw內(nèi)致敏的過程以一種有害結(jié)局通路(AOP)的形式通過系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模擬。皮膚致敏的誘導(dǎo)階段,朗格漢斯細(xì)胞(LC)起著決定性的作用,通過呈遞和修飾抗原承擔(dān)著啟動(dòng)免疫反應(yīng)的作用。在這個(gè)過程中,LC成熟表現(xiàn)為:II型組織相容性復(fù)合物(MHC)的上調(diào)、共刺激分子的表達(dá)上調(diào)(CD86、CD54、CD80和CD40),同時(shí)還有IL-18表達(dá)增加的現(xiàn)象。許多抗原特異性的免疫反應(yīng)方法使用的是樹突狀細(xì)胞(DCs),其中包括LC。相關(guān)研究嘗試使用這類原代細(xì)胞,但是由于捐獻(xiàn)者的差異性問題,導(dǎo)致該細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中存在不穩(wěn)定性。為避免此類問題,通過一些DCs細(xì)胞系進(jìn)行模擬該類細(xì)胞,例如:THP-1細(xì)胞、U937細(xì)胞(人組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞系)、KG-1細(xì)胞(人骨髓性白血病細(xì)胞系)和MUTZ-3(人單核細(xì)胞系)。本研究基于THP-1細(xì)胞的皮膚致敏檢測方法(h-CLAT),聯(lián)合Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞和EpiskinTM皮膚模型進(jìn)行皮膚致敏篩查實(shí)驗(yàn),通過THP-1細(xì)胞表面CD86/CD54的改變對(duì)物質(zhì)的致敏情況進(jìn)行判斷。研究目的構(gòu)建體外培養(yǎng)的h-CLAT皮膚致敏檢測系統(tǒng),并分別結(jié)合Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞和EpiskinTM皮膚模型,塑造不同的皮膚致敏整合測試方法。通過監(jiān)測暴露受試物后的細(xì)胞活率、白介素18(IL-18)表達(dá)情況、細(xì)胞表面標(biāo)志物CD54/CD86表達(dá)情況和相對(duì)熒光強(qiáng)度,建立基于h-CLAT的皮膚致敏實(shí)驗(yàn)整合測試體系,為化學(xué)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的皮膚致敏特性提供預(yù)測和評(píng)估。研究內(nèi)容與方法第一部分、h-CLAT皮膚致敏檢測方法的研究1.細(xì)胞培養(yǎng):THP-1細(xì)胞:使用RPMI1640培養(yǎng)基,加入10%的胎牛血清(FBS),25m M 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),0.05m M巰基乙醇和1%青霉素-鏈霉素(雙抗)。2.物質(zhì)篩查:使用非致敏物:十二烷基磺酸鈉、乳酸;弱致敏物:肉桂醇、丁香酚;中等致敏物:檸檬醛、肉桂醛、苯乙醛;強(qiáng)致敏物:沒食子酸丙酯、馬來酸酐;極強(qiáng)致敏物:苯醌、二硝基氯苯進(jìn)行h-CLAT皮膚致敏的方法構(gòu)建。建立方法后對(duì)樣品:微乳卸妝液、松茸提取物、當(dāng)歸提取物和黃芩提取物進(jìn)行預(yù)測。第二部分、聯(lián)合Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞系和h-CLAT的皮膚致敏檢測方法研究1.細(xì)胞培養(yǎng):Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞:使用RPMI1640培養(yǎng)基,10%的胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素(雙抗);THP-1細(xì)胞與Ha Ca T細(xì)胞共培養(yǎng)采用BD Falcon插入式培養(yǎng)皿于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)中孵育。2.物質(zhì)篩查:使用十二烷基磺酸鈉、丁香酚、肉桂醛和二硝基氯苯處理Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞,分別獲取4種物質(zhì)對(duì)應(yīng)的IC50;采用IL-18檢測試劑盒檢測上述4種物質(zhì)作用后的Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞和共培養(yǎng)系統(tǒng)的IL-18表達(dá)情況;構(gòu)建Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的共培養(yǎng)皮膚致敏方法,并對(duì)上述4種物質(zhì)的致敏性進(jìn)行檢測。第三部分、聯(lián)合EpiskinTM皮膚模型和h-CLAT的皮膚致敏檢測方法研究1.皮膚模型培養(yǎng):EpiskinTM皮膚模型:使用MEM培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基為購買皮膚模型時(shí)附帶。與THP-1細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)中共同孵育。2.物質(zhì)篩查:使用十二烷基磺酸鈉、丁香酚、肉桂醛和二硝基氯苯處理該共培養(yǎng)皮膚致敏檢測系統(tǒng),并與Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。最后,將建立的共培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)6種清潔類產(chǎn)品進(jìn)行皮膚致敏性檢測。研究結(jié)果第一部分、h-CLAT皮膚致敏檢測方法的研究本研究對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行了9種皮膚致敏陽性物質(zhì)和2種皮膚致敏陰性物質(zhì)的暴露,并對(duì)作用下的細(xì)胞活率、細(xì)胞表面分子CD54和CD86進(jìn)行檢測,并獲得相應(yīng)的引起致敏反應(yīng)的最低濃度EC150(CD86)和EC200(CD54)。方法順利構(gòu)建后,通過該方法對(duì)微乳卸妝液、松茸提取物、當(dāng)歸提取物和黃芩提取物進(jìn)行了皮膚致敏檢測,并判斷當(dāng)歸和黃芩提取物為陽性物質(zhì),另外兩種為陰性物質(zhì)。第二部分、聯(lián)合Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞系和h-CLAT的皮膚致敏檢測方法研究本實(shí)驗(yàn)中引入Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞,并對(duì)受試物作用下角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子IL-18進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)其在單層角質(zhì)細(xì)胞和共培養(yǎng)體系中都顯著增加(P0.05)。隨后,將無毒性情況下的IL-18聯(lián)合DNCB作用THP-1細(xì)胞,結(jié)果與單獨(dú)DNCB處理組并無顯著性差異(P0.05)。后續(xù)對(duì)兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)分別檢測SLS、丁香酚、肉桂醛和DNCB,發(fā)現(xiàn)相對(duì)h-CLAT皮膚致敏系統(tǒng),共培養(yǎng)系統(tǒng)的CD86/CD54熒光強(qiáng)度并未顯著增強(qiáng)(P0.05)。但是,該模型同一條件下可以檢測物質(zhì)的刺激性和致敏性,同時(shí)也為構(gòu)建后續(xù)皮膚模型測試體系起到初篩受試物濃度的作用。第三部分、聯(lián)合EpiskinTM皮膚模型和h-CLAT的皮膚致敏檢測方法的研究為了優(yōu)化Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,使用具有生物活性的皮膚三維結(jié)構(gòu)模型EpiskinTM與THP-1細(xì)胞進(jìn)行4種物質(zhì)的皮膚致敏性檢測。最終發(fā)現(xiàn),3種陽性物質(zhì)在皮膚模型整合h-CLAT測試條件下,相較于單純的THP-1細(xì)胞皮膚致敏檢測系統(tǒng)和THP-1細(xì)胞與Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng),相對(duì)熒光強(qiáng)度增加顯著(P0.05)。最后,使用該模型對(duì)6種清潔類護(hù)理品進(jìn)行了皮膚致敏檢測。研究結(jié)論本研究通過已知的9種皮膚致敏陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2種陰性物質(zhì)建立了h-CLAT皮膚致敏測試方法,并對(duì)4種樣品進(jìn)行區(qū)分。同時(shí),為了強(qiáng)化單一細(xì)胞檢測體系,加入Ha Ca T角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)模型,并對(duì)3種皮膚致敏陽性物質(zhì)和1種陰性物質(zhì)進(jìn)行了準(zhǔn)確區(qū)分,成功構(gòu)建了基于IL-18細(xì)胞因子的皮膚刺激性和皮膚致敏性聯(lián)合檢測系統(tǒng)。最后,為更加契合化妝產(chǎn)品和個(gè)人護(hù)理品等物質(zhì)對(duì)人體皮膚的作用條件,聯(lián)合皮膚模型與THP-1細(xì)胞構(gòu)建三維皮膚致敏評(píng)估結(jié)構(gòu),并對(duì)3種皮膚致敏陽性物質(zhì)、1種陰性物質(zhì)和6種清潔類成品進(jìn)行了區(qū)分,結(jié)果表明該系統(tǒng)能夠?qū)ζつw致敏物質(zhì)做出正確判斷,并且相對(duì)上述兩個(gè)檢測系統(tǒng)受試物的檢測類型更豐富。
【關(guān)鍵詞】：皮膚致敏 THP-1細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞 皮膚模型 共培養(yǎng)系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.2
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-15
• 前言15-21
• 1.皮膚致敏15
• 2.皮膚致敏篩查方法15-16
• 3.皮膚致敏有害結(jié)局通路16-18
• 4.整合策略化測試方法18-19
• 5.本文研究的目的和意義19-21
• 第一部分 h-CLAT皮膚致敏檢測方法的研究21-46
• 1.材料與方法21-31
• 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-42
• 3.討論42-45
• 4.結(jié)論45-46
• 第二部分 聯(lián)合HaCaT角質(zhì)細(xì)胞系和h-CLAT的皮膚致敏檢測方法研究46-63
• 1.材料與方法46-52
• 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-59
• 3.討論59-62
• 4.結(jié)論62-63
• 第三部分 聯(lián)合Episkin~(TM)皮膚模型和h-CLAT的皮膚致敏檢測方法研究63-73
• 1.材料與方法63-66
• 2.結(jié)果66-69
• 3.討論69-72
• 4.結(jié)論72-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-81
• 綜述81-93
• 參考文獻(xiàn)90-93
• 附錄 縮略詞表93-94
• 在研期間科研成績94-95
• 致謝95

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳_g;整合三維結(jié)構(gòu)的h-CLAT皮膚致敏檢測方法研究[D];廣東藥科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：830509