本文關(guān)鍵詞：姜黃素影響HaCaT細胞增殖的靶點及對TPA誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的作用研究

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【摘要】：尋常型銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，臨床表現(xiàn)為與周圍皮膚界限分明的紅色隆起，表面常帶有白色小半鞘翅。因其發(fā)病部位常分布在全身各處且伴隨劇烈瘙癢，嚴重影響外觀和患者的生活質(zhì)量。銀屑病又極易反復(fù)發(fā)作，因此給患者帶來極大的生理、心理和經(jīng)濟負擔(dān)。盡管銀屑病在我國的發(fā)病率較歐美地區(qū)低，但總體患病人數(shù)較多。長期以來人們認為銀屑病是一種免疫細胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，但銀屑病具體的發(fā)病機制還不甚清楚，目前主要認為是以IL-23、IL-17A、IL-17F、IL-22、TNF-α、IFN-γ、IL-1β等IL-23/IL-17/IL-22細胞因子軸為中心、固有免疫細胞和活化的T細胞參與、功能失調(diào)的角質(zhì)形成細胞共同作用的結(jié)果。目前針對尋常型銀屑病的治療主要集中免疫抑制劑（如：環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、阿維A、他克莫司等）、激素治療（丙酸倍他米松、維A酸類、丙酸氯倍他索等）、窄譜光照射療法等，由于其副作用及不良反應(yīng)因而限制了其應(yīng)用。針對銀屑病發(fā)病機制中較關(guān)鍵的炎癥因子infliximab、etanercept、adalimumab等生物制劑由于其靶向性更強等取得了很好的臨床療效，但由于其價格昂貴且停藥后易復(fù)發(fā)等缺點，迫使人們繼續(xù)尋找新的安全、有效、經(jīng)濟的抗銀屑病藥物。 姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的黃色粉末，由于其抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理活性及安全性等越來越受到人們的關(guān)注。但由于其水溶性較差，口服生物利用度很低等缺點，目前主要用于克羅恩氏病、乳腺癌等的研究。很早也有關(guān)于姜黃素用于銀屑病的臨床研究，可以有效改善銀屑病患者皮損癥狀，但該實驗樣本量小且缺乏有效的對照等缺點，主要是由于姜黃素口服生物利用度較低。但為姜黃素皮膚局部給藥治療銀屑病提供了理論支持。目前人們對姜黃素研究的熱點是將其結(jié)構(gòu)改造后增加水溶性進而對其藥效學(xué)進行考察，或制成新劑型以改善其生物利用度。 本課題的研究目的是利用姜黃素凝膠，通過經(jīng)皮給藥的方式考察姜黃素對銀屑病小鼠模型的作用及其機制。 本課題主要進行了以下研究內(nèi)容：第一部分：姜黃素對IL 22誘導(dǎo)下角質(zhì)形成細胞增殖的影響及機制研究 銀屑病時IL-22大量增加，主要作用為刺激角質(zhì)過度增殖并抑制其分化，最終引起表皮增厚；另一方面還可以刺激角質(zhì)形成細胞(KC)產(chǎn)生炎癥因子IL-20，和IL-22發(fā)揮協(xié)同作用，加重皮膚炎癥狀況；同時上調(diào)抗菌蛋白S100A7、S100A8、S100A9等使銀屑病皮膚抗菌性增強。 1、本部分研究首先考察姜黃素對IL-22誘導(dǎo)永生化的人角質(zhì)形成細胞(HaCaT)生長狀況的影響，分別利用20ng/ml和100ng/ml的IL-22刺激HaCaT細胞2h后，再利用姜黃素刺激。每隔6h通過CCK-8測活細胞吸光度，記錄各處理組細胞吸光度從而記錄細胞生長曲線。無論IL-22是否存在，姜黃素均可以抑制HaCaT的增殖。 2、探討了姜黃素抑制細胞增殖的機制：IL-22與KC上的受體結(jié)合后，主要通過激活JAK-STAT3通路發(fā)揮作用。本研究利用western-blot檢測了不同處理組STAT3的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)姜黃素不僅強烈抑制了IL-22誘導(dǎo)的STAT3磷酸化，而且?guī)缀跬耆种屏苏＜毎麅?nèi)的磷酸化。 3、周期蛋白是調(diào)控細胞增殖重要的內(nèi)部因素。本研究利用real-time PCR檢測了姜黃素作用2h和6h后周期蛋白cyclin D1和cyclin E在各處理組中的表達。此外還利用western-blot檢測了姜黃素作用24h后不同處理組中cyclin D1和cyclin E的變化。結(jié)果顯示，與空白組相比，IL-22對周期蛋白的影響不顯著，但姜黃素在核酸和蛋白水平上均顯著抑制了IL-22誘導(dǎo)后周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表達。 4、考察了姜黃素對IL-22誘導(dǎo)的IL-20影響：利用real-time PCR對姜黃素作用6h后對IL-20mRNA的表達做出檢測；同時利用ELISA對姜黃素作用24h后IL-20的量進行了考察。結(jié)果顯示，與空白組相比，姜黃素和IL-22在核酸水平對IL-22的影響不顯著，但姜黃素在蛋白水平上調(diào)了IL-22誘導(dǎo)下IL-20的表達。 結(jié)論：姜黃素可以抑制IL-22誘導(dǎo)下HaCaT細胞的增殖，其作用可能表現(xiàn)為一方面通過抑制STAT3磷酸化，另一方面可能是通過抑制PI3K通路，，下調(diào)了周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表達。第二部分：通過IL-17F、IL-17A單用或聯(lián)合IFN-γ、TNF-α、IL-6刺激角質(zhì)形成細胞，研究其對IL-22表達的誘導(dǎo)作用 在本課題組另一部分實驗——姜黃素對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的治療作用及其機制時發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特刺激小鼠時，在IL-23的誘導(dǎo)下，來源于真皮δγT細胞的IL-17A、IL-17F表達上調(diào)，同樣主要來源于δγT細胞的IL-22表達明顯上調(diào)，且表達量是IL-17A和IL-17F的數(shù)十倍甚至百倍。因此，推測IL-17A或IL-17F是否刺激了其它的細胞（如KC）產(chǎn)生IL-22，進而將炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大？由于此模型中INF-γ、TNF-α、IL-6也高表達，是否存在IL-17A/IL-17F在INF-γ、TNF-α、IL-6的協(xié)調(diào)作用下刺激KC產(chǎn)生了大量的IL-22的可能？為此本課題進行了如下實驗： 1、利用real-time PCR考察IL-17A或IL-17F單獨刺激KC時，是否引起IL-22基因表達上調(diào)。結(jié)果顯示，IL-17A和IL-17F單獨作用時，IL-22的表達和空白組相比無差異，均沒有IL-22基因的擴增。 2、利用real-time PCR考察IL-17A或IL-17F聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6刺激KC時，是否能夠引起IL-22基因表達上調(diào)。結(jié)果顯示，以上刺激因素均不能引起IL-22目的基因的擴增，不能產(chǎn)生IL-22。 3、利用ELISA分別對IL-17A、IL-17F聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6作用24h后的KC細胞上清進行收集，檢測是否有IL-22的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，與空白組相比，兩種條件刺激下IL-22的蛋白水平和空白組基本無差異，且量很少，可以認為IL-17A、IL-17F聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6作用于KC時，不能引起IL-22的表達。 結(jié)論：IL-17A或IL-17F單獨或聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6刺激KC不能產(chǎn)生IL-22。第三部分：姜黃素對TPA誘導(dǎo)的K14-VEGF銀屑病小鼠模型的影響及作用機制研究 本部分研究首先比較了野生型和6-8周轉(zhuǎn)基因小鼠生理基線的差異：利用數(shù)碼相機記錄小鼠耳部皮膚形態(tài)學(xué)；數(shù)字測厚儀測量并記錄野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的耳厚；通過HE染色對兩種小鼠耳部皮膚組織學(xué)特征進行比較；采用real-time PCR對兩種小鼠耳部皮膚中IL-23/IL17/IL-22作用軸上的一系列細胞因子進行了考察，此外，還利用western-blot和免疫組化對γδT細胞在兩種小鼠耳部皮膚中的分布、及真皮中的表達進行了考察。 與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠耳部皮膚自發(fā)產(chǎn)生紅腫、血管明顯、增厚。HE染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠由于表皮基底層輕微增殖而增厚、皮下組織增生，同時伴有部分炎癥細胞浸潤和水腫。Real-time PCR考察結(jié)果顯示，除IL-23外，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在其它細胞因子（如：IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-21、TNF、IL-6、VEGF等）水平上無差異，但western-blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠VEGF表達明顯增強，真皮中γδT細胞特異性標記物CCR6無明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示，γδT細胞在兩種小鼠耳部皮膚中的分布及表達無差異。 結(jié)論：由于周齡較小，K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠VEGF表達明顯增強，但由于缺乏IL-1β的聯(lián)合刺激，真皮中的γδT細胞并未增殖活化，因此IL-6、TNF、IL-17等還未高表達，和野生型小鼠相比，6-8周轉(zhuǎn)基因小鼠只出現(xiàn)了輕微的表皮增厚，并未有顯著的組織學(xué)變化，與以往報導(dǎo)的研究一致。 在對野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠比較的基礎(chǔ)上，本課題考察了姜黃素對TPA誘導(dǎo)的K14-VEGF銀屑病小鼠模型的影響及作用機制研究。此部分實驗分為5組：轉(zhuǎn)基因小鼠空白對照組、TPA模型誘導(dǎo)組、姜黃素單獨作用組、姜黃素治療組、丙酸氯倍他索治療組。各組按以下內(nèi)容進行： 1、在實驗的第0、2、4、6、8、10、12天測量、記錄小鼠耳厚，并對各處理組小鼠耳部皮膚進行炎癥評分。在實驗進行的第12天利用數(shù)碼相機記錄不同處理組間小鼠耳部皮膚的形態(tài)學(xué)差異。通過HE染色對不同處理組的小鼠耳部皮膚組織學(xué)變化進行分析。結(jié)果顯示，TPA作用于K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠耳部皮膚后，誘導(dǎo)其產(chǎn)生了紅腫、增厚、鱗屑、血管明顯等銀屑病樣癥狀，姜黃素則逆轉(zhuǎn)了上述銀屑病樣癥狀。HE染色表明，TPA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生表皮增厚、水腫、大量炎癥細胞浸潤等，姜黃素和丙酸氯倍他索減輕了以上癥狀。 2、利用免疫組化和western-blot考察不同處理因素對小鼠耳部皮膚中δγT細胞的影響，主要采用標記CCR6記錄各處理因素對真皮中δγT的影響；利用western-blot檢測δγTCR和RORγ來考察δγT整體水平的變化。免疫組化和western-blot結(jié)果表明，TPA促進了δγT細胞的增殖，但真皮中的CCR6+δγT細胞增殖并不顯著，表皮中的δγT大量增加，姜黃素和丙酸氯倍他索對TPA誘導(dǎo)的表皮δγT增殖無顯著影響。 3、利用real-time PCR對各處理組小鼠耳部皮膚中的炎癥因子IL-23、IL-1β、IL-17A、 IL-17F、IL-22、TNF-α、IL-6、IL-21、VEGF等進行考察，探明姜黃素的作用機制。結(jié)果表明TPA并不通過激活I(lǐng)L-23/IL-17/IL-22作用軸誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生銀屑病樣特征，姜黃素也不通過此通路發(fā)揮作用,但姜黃素不能抑制VEGF的高表達。 4、為進一步探明TPA誘導(dǎo)K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生銀屑病的機制及姜黃素對其治療機制，利用real-time PCR對各處理組小鼠耳部皮膚中炎癥因子IL-12、IL-27、IFN-γ、IL-2、CXCL9、CXCL10的變化進行了考察。結(jié)果表明，TPA誘導(dǎo)下Th1型上游炎癥因子IL-27及下游炎癥因子IFN-γ、及相應(yīng)趨化因子CXCL9、CXCL10高表達，而姜黃素和丙酸氯倍他索則顯著下調(diào)了TPA誘導(dǎo)的以上炎癥因子的上調(diào)。 結(jié)論：TPA可以誘導(dǎo)短周齡K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)銀屑病樣特征，但這種作用并不依賴于δγT的增殖和激活，此外，IL-23/IL-17/IL-22作用軸上一系列細胞因子并不參與此炎癥過程。TPA誘導(dǎo)K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)銀屑病樣癥狀是TPA作用于皮膚后，通過激活I(lǐng)L-27/Th1/IFN-γ通路誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了長期的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，產(chǎn)生大量的IFN-γ、CXCL9、CXCL10等Th1型炎癥因子，與VEGF慢性過表達造成的血管炎性反應(yīng)相互作用，造成了銀屑病樣癥狀。姜黃素有效減輕銀屑病樣癥狀可能是通過滅活I(lǐng)L-27誘導(dǎo)下Th1的活化和TPA誘導(dǎo)下蛋白激酶C的活化從而發(fā)揮作用，在對抗TPA作用于K14/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠時可以進一步誘導(dǎo)VEGF高表達，但一方面可以通過阻斷VEGF與受體結(jié)合后激活的下游信號通路，另一方面通過負反饋機制下調(diào)了VEGFR的表達，從而阻斷VEGF的作用。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 姜黃素 TPA VEGF 增殖 IL-23 IL-27 IFN-γ
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R758.63
【目錄】：

• 摘要9-13
• Abstract13-18
• 縮略詞表（Abbreviations）18-19
• 前言19-29
• 一、細胞因子在銀屑病發(fā)病機制中的作用20-25
• 二、異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在銀屑病發(fā)病機制中的作用25-26
• 三、銀屑病的治療現(xiàn)狀26-27
• 四、姜黃素對銀屑病的作用靶點27-29
• 第一部分、姜黃素對 IL-22 誘導(dǎo)下角質(zhì)形成細胞的影響29-39
• 一、實驗材料29-30
• (一) 試劑29-30
• (二) 儀器30
• 二、實驗方法30-34
• (一) 細胞培養(yǎng)30
• (二) 姜黃素對 IL-22 誘導(dǎo)下 HaCaT 細胞生長曲線的影響30
• (三) real-time PCR 考察30-32
• (四) Western blot 考察32-33
• (五) ELISA 檢測姜黃素對 IL-22 誘導(dǎo)下 KC 分泌 IL-20 的影響33-34
• 三、統(tǒng)計方法34
• 四、實驗結(jié)果34-38
• (一) 姜黃素抑制了 IL-22 誘導(dǎo)下 HaCaT 細胞的增殖34-35
• (二) 姜黃素抑制了 IL-22 誘導(dǎo)下 STAT3 的活化35-36
• (三) 姜黃素促進了 IL-22 誘導(dǎo)下 IL-20 的產(chǎn)生36-37
• (四) 姜黃素對 IL-22 誘導(dǎo)下 HaCaT 細胞 cyclin D1 和 cyclin E 的表達有影響37-38
• 五、討論38-39
• 第二部分、探討 IL-22 在角質(zhì)形成細胞中產(chǎn)生途徑及其與 IL-17A、IL-17F、IFN-γ、TNF-α、IL-6 的關(guān)聯(lián)性39-50
• 一、實驗材料40
• (一) 試劑40
• (二) 儀器40
• 二、實驗方法40-42
• (一) 細胞培養(yǎng)40
• (二) Real-time PCR 檢測40-41
• (三) ELISA 檢測各實驗組 IL-22 的表達41-42
• 三、統(tǒng)計方法42
• 四、實驗結(jié)果42-49
• (一) 引物特異性檢測：Real-time PCR 溶解曲線42-43
• (二) IL-17A 單獨作用于 KC 不能誘導(dǎo) IL-22mRNA 的表達43-44
• (三) IL-17F 單獨作用于 KC 不能誘導(dǎo) IL-22mRNA 的表達44-45
• (四) IL-17F 聯(lián)合 TNF、IFN-γ、IL-6 聯(lián)用不能誘導(dǎo) KC 中 IL-22 的 mRNA 的表達45-47
• (五) IL-17A 聯(lián)合 TNF、IFN-γ、IL-6 聯(lián)用無法誘導(dǎo) KC 中 IL-22 的 mRNA 的表達47-49
• (六) IL-17A 和 IL-17F 與 TNF、IFN-γ、IL-6 聯(lián)用不能誘導(dǎo) KC 產(chǎn)生 IL-2249
• 五、討論49-50
• 第三部分、姜黃素對 TPA 誘導(dǎo)的 K14-VEGF 銀屑病模型小鼠的作用50-101
• 一、實驗材料52-54
• (一) 實驗動物52
• (二) 主要試劑及儀器52-53
• (三) 主要試劑的制備53-54
• 二、實驗方法54-59
• (一) 動物分組及給藥54
• (二) TPA 誘導(dǎo) K14-VEGF 轉(zhuǎn)基因小鼠54-55
• (三) 耳部皮膚組織厚度的測量55
• (四) 銀屑病表型的觀測和評分55
• (五) 小鼠耳組織病理學(xué)活檢55-56
• (六) 耳組織免疫組化檢測56-57
• (七) Western-blot 考察57
• (八) Real-time PCR 考察57-59
• 三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計59
• 四、實驗結(jié)果59-85
• (一) 野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠耳部皮膚的差異59-66
• (二) 姜黃素對 TPA 誘導(dǎo)的 K14-VEGF 轉(zhuǎn)基因小鼠銀屑病模型的影響66-75
• (三) 姜黃素對 TPA 誘導(dǎo)下小鼠耳組織中 IL-23、IL-17A、IL-17F、IL-22 等促炎因子的影響75-80
• (四) 姜黃素對 TPA 誘導(dǎo)下小鼠耳組織中促炎因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF 等的影響80
• (五) 姜黃素對 TPA 誘導(dǎo)下小鼠耳組織中促炎因子 IL-12、IL-27、IFN-γ、IL-2、CXCL9、CXCL10 等的影響80-83
• (六) 姜黃素對 TPA 誘導(dǎo)下 K14-VEGF 轉(zhuǎn)基因小鼠耳組織中血管增生的影響83-85
• (七) K14-VEGF 轉(zhuǎn)基因小鼠及 TPA 誘導(dǎo) K14-VEGF 轉(zhuǎn)基因小鼠與人銀屑病癥狀的比較85
• 五、討論85-101
• 全文總結(jié)101-107
• 參考文獻107-114
• 綜述114-120
• Reference117-120
• 附錄120-122
• 發(fā)表文章及主要獲獎情況122-123
• 致謝123-124

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 呂晶;徐軍發(fā);;Th22細胞:一種新型的輔助型T細胞[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2011年01期

2 沈二霞;楊寶欣;李e

本文編號：782066