發(fā)布時(shí)間：2017-08-28 15:26

  本文關(guān)鍵詞：表皮干細(xì)胞分裂參與銀屑病斑塊皮損持續(xù)增殖的分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 角質(zhì)形成細(xì)胞 有絲分裂 白細(xì)胞介素 干細(xì)胞 銀屑病

【摘要】：研究背景及目的 銀屑病(psoriasis)是一種常見的多基因遺傳,多種因素參與的慢性炎癥性皮膚病。發(fā)病率約為2%,可累及所有種族。臨床上存在難治愈,易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),嚴(yán)重影響患者身心健康。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖以及異常分化是其主要病理特征。很長(zhǎng)時(shí)間以來,人們?cè)谔骄裤y屑病的發(fā)病機(jī)制時(shí),著眼點(diǎn)都放在角質(zhì)形成細(xì)胞上,認(rèn)為銀屑病是一種角質(zhì)形成細(xì)胞疾病。然而,這種觀點(diǎn)并不能解釋銀屑病病理中淋巴細(xì)胞(絕大多數(shù)為T細(xì)胞)浸潤(rùn),真皮血管改變等特征。隨著免疫因素在銀屑病發(fā)病中的作用越來越清晰,進(jìn)而提出銀屑病是一種T細(xì)胞免疫介導(dǎo)性皮膚病。其中CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能異常在其發(fā)病中尤為重要。 近年來,發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細(xì)胞亞群Thl7細(xì)胞,以高表達(dá)IL-17為特征,在銀屑病發(fā)病中的作用已成為研究的熱點(diǎn)。初始T細(xì)胞在TGF-p和IL-6的共同作用下通過特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt分化發(fā)育成為Th17細(xì)胞�；罨臉渫粻罴�(xì)胞分泌大量IL-23,它與Th17細(xì)胞表面的IL-23R結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄因子STAT3誘導(dǎo)IL-17A、IL-17F、IL-22等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。這些細(xì)胞因子與角質(zhì)形成細(xì)胞上的相應(yīng)受體IL-17R, IL-22R結(jié)合發(fā)揮炎癥和促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化的作用。由此可見,銀屑病更是一種角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間相互作用失衡的疾病。然而,對(duì)表皮干細(xì)胞在銀屑病表皮增殖中的作用及其在持續(xù)增殖狀態(tài)下如何免遭基因組復(fù)制錯(cuò)誤或突變以維持干細(xì)胞群數(shù)目恒定的機(jī)制仍知之甚少。 表皮細(xì)胞可分為三種亞群,即表皮干細(xì)胞(epithelial stem cells; ESCs),短暫擴(kuò)充細(xì)胞(transit amplifying cells; TACs)和有絲分裂后分化細(xì)胞(postmitotic cells; PMCs)。ESCs在皮膚穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。大多數(shù)情況下,表皮干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)受到創(chuàng)傷或理化等因素刺激時(shí),可激活并增殖分化參與皮膚穩(wěn)態(tài)的修復(fù)使表皮始終處于增殖、分化和脫屑狀態(tài),并且增殖與脫屑的速度保持大致平衡。細(xì)胞從基底層到達(dá)皮膚表面的時(shí)間,包括表皮細(xì)胞由基底層增殖、分化過渡到棘細(xì)胞層以及進(jìn)一步分化為無完整細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的角質(zhì)層所需要的時(shí)間,稱之為表皮通過時(shí)間。正常皮膚的表皮通過時(shí)間為52～75天,但在銀屑病這一時(shí)間大大縮短,僅8-10天。ESCs通過對(duì)稱和不對(duì)稱分裂進(jìn)行增殖。前者多發(fā)生于胚胎發(fā)育過程以增加皮膚表面積或成體皮膚穩(wěn)態(tài)遭遇傷害后的增殖修復(fù)過程中,而后者在使干細(xì)胞產(chǎn)生子代干細(xì)胞維持自身特性(自我更新)的同時(shí)也能產(chǎn)生分化的子代細(xì)胞-短暫擴(kuò)充細(xì)胞。短暫擴(kuò)充細(xì)胞經(jīng)過幾次短暫細(xì)胞分裂后退出細(xì)胞周期進(jìn)入終末分化程序,且一旦開始便不能逆轉(zhuǎn)。因此不對(duì)稱分裂是其維持恰當(dāng)?shù)母杉?xì)胞數(shù)量的一種方式,因而被認(rèn)為是干細(xì)胞的典型特征。表皮中的不對(duì)稱細(xì)胞分裂類型有兩種：一種是紡錘體平行于基底膜,另一種是細(xì)胞分裂平面垂直于基底膜。發(fā)生在成體皮膚中的分裂層面和基底膜平行的不對(duì)稱分裂模式,兩個(gè)子細(xì)胞暫時(shí)都在基底層,其中一個(gè)子細(xì)胞可能接受了不等量的調(diào)控整合素分子表達(dá)下調(diào)隨后使其脫離基底層的信號(hào)。一旦對(duì)稱和不對(duì)稱分裂的精密調(diào)控被破壞,不僅會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞數(shù)量的改變,還會(huì)促使TA細(xì)胞群極度擴(kuò)增導(dǎo)致皮膚表皮持續(xù)增殖。DNA“不死”鏈(DNAimmortal strands)假說認(rèn)為,成體干細(xì)胞(adult stem cells)在分裂過程中,含有相對(duì)比較古老的DNA鏈(又被稱作“不死”鏈)的染色體總是被分配給將要成為干細(xì)胞的子代細(xì)胞,含有相對(duì)新合成DNA鏈的染色體被分配給趨向分化并最終衰老死亡的另一個(gè)子代細(xì)胞。這樣通過“不死”DNA鏈在子代細(xì)胞和干細(xì)胞中的不對(duì)稱分配,使“不死”DNA鏈永遠(yuǎn)保留在干細(xì)胞中保護(hù)其基因組避免可能發(fā)生的復(fù)制錯(cuò)誤和突變。因此我們推測(cè)銀屑病斑塊持續(xù)增殖的原動(dòng)力可能為1)銀屑病表皮基底層干細(xì)胞很可能被激活,以水平和垂直不對(duì)稱分裂方式迅速增殖產(chǎn)生大量TA細(xì)胞,導(dǎo)致銀屑病表皮TA細(xì)胞群極度擴(kuò)增(圖1-7)；2)銀屑病基底層干細(xì)胞在不對(duì)稱分裂過程中,總是把含有相對(duì)比較古老的DNA鏈(“不死”鏈)的染色體分配給將要成為干細(xì)胞的子代細(xì)胞,把含有相對(duì)新合成DNA鏈的染色體分配給趨向分化并最終衰老死亡的另一個(gè)子代細(xì)胞(圖2-2),以保護(hù)其基因組避免在持續(xù)增殖狀態(tài)下可能發(fā)生的復(fù)制錯(cuò)誤來保證干細(xì)胞群不被耗竭； 表皮終末分化是一個(gè)精細(xì)調(diào)節(jié)的過程,細(xì)胞由基底層向基底淺層遷移是分化過程關(guān)鍵性的第一步,在分化過程的每個(gè)階段高度表達(dá)特異性角蛋白。在表皮基底層分裂活躍的角質(zhì)形成細(xì)胞主要表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物角蛋白15(Keratin; K15);當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞移行至棘層時(shí)失去分裂能力,便關(guān)閉K15的表達(dá),開啟分化特異性角蛋白K10的表達(dá)。 因此,在本研究中,我們用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)了銀屑病斑塊皮損和正常人皮膚中干細(xì)胞以及增殖、分化相關(guān)標(biāo)記物,觀察銀屑病斑塊皮損TA細(xì)胞群變化；用溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine; BrdU)標(biāo)記IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠,檢測(cè)基底層干細(xì)胞有絲分裂；用BrdU脈沖示蹤技術(shù)研究人角質(zhì)形成細(xì)胞DNA模板鏈分離,觀察比較銀屑病和正常人表皮細(xì)胞發(fā)生不對(duì)稱分裂的比例；用IL-17A和IL-22處理人角質(zhì)形成細(xì)胞和從皮膚移植物邊緣長(zhǎng)出的第一代表皮細(xì)胞片(epidermal cell sheet),觀察其對(duì)分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,以期揭示表皮干細(xì)胞活化及其參與銀屑病表皮持續(xù)性增厚的方式和可能涉及的分子機(jī)制。 研究方法與結(jié)果 1.斑塊型銀屑病皮損中TA細(xì)胞群擴(kuò)增：用免疫組化技術(shù)檢測(cè)銀屑病皮損和正常皮膚標(biāo)本干細(xì)胞標(biāo)記蛋白(K15和ITGB1),TA細(xì)胞標(biāo)記蛋白(ITGB1),有絲分裂后細(xì)胞(PMCs)標(biāo)記蛋白(K10)和細(xì)胞增殖標(biāo)記抗原(Ki67)。結(jié)果顯示與正常皮膚相比,銀屑病表皮ITGB1和K15的表達(dá)明顯降低,基底淺層細(xì)胞Ki67陽(yáng)性染色比例顯著增加,K10陽(yáng)性角質(zhì)形成細(xì)胞卻延遲出現(xiàn),直到棘層淺層才有陽(yáng)性染色。 2.IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮炎基底層細(xì)胞有絲分裂相觀察：用咪喹莫特乳膏外搽小鼠背部皮膚,每天一次,連續(xù)6天后,小鼠背部皮膚增厚,有紅斑、鱗屑,發(fā)生類似銀屑病樣改變。用BrdU標(biāo)記IMQ誘導(dǎo)的皮炎小鼠,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)其基底細(xì)胞有絲分裂的細(xì)胞數(shù),結(jié)果表明小鼠皮炎模型中檢測(cè)到BrdU標(biāo)記的基底細(xì)胞有絲分裂比例為6%,而對(duì)照組為幾乎檢測(cè)不到。在IMQ處理組,BrdU標(biāo)記基底層細(xì)胞存在兩種不對(duì)稱細(xì)胞分裂方式,水平和垂直細(xì)胞分裂。 3.銀屑病與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生不對(duì)稱分裂比例比較：用BrdU脈沖示蹤標(biāo)記方法,檢測(cè)原代培養(yǎng)的銀屑病和正常人角質(zhì)形成細(xì)胞有絲分裂時(shí)DNA模板鏈分離方式。結(jié)果表明,銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)BrdU標(biāo)記發(fā)生不對(duì)稱分離比例(約為10%)比正常表皮細(xì)胞(僅3%)高。銀屑病與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞模板鏈分離和K15表達(dá)的關(guān)系比較：用BrdU脈沖示蹤標(biāo)記原代培養(yǎng)的銀屑病和正常人角質(zhì)形成細(xì)胞,免疫雙標(biāo)方法檢測(cè)BrdU標(biāo)記的模板鏈分離和K15表達(dá)。結(jié)果表明,進(jìn)行不對(duì)稱分裂的原代角質(zhì)形成細(xì)胞通常把模板鏈(未標(biāo)記鏈)分配到表達(dá)K15的子細(xì)胞中。銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞同時(shí)表達(dá)K15且不對(duì)稱標(biāo)記BrdU(假定為第二輪細(xì)胞分裂中的不對(duì)稱干細(xì)胞分裂)的比例(～13%)比正常增加(P＜0.05)。銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞同時(shí)表達(dá)K15且對(duì)稱性標(biāo)記BrdU(假定為第二輪細(xì)胞分裂中的干細(xì)胞自我更新)的比例(～32%)也比正常增加(P＜0.05)。 4.IL-17A和IL-22對(duì)從皮膚移植物邊緣長(zhǎng)出的第一代表皮細(xì)胞片(epidermal cell sheets)和原代培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞,表達(dá)增殖、分化相關(guān)抗原的影響：用從皮膚移植物邊緣長(zhǎng)出第一代上皮細(xì)胞組成的上皮細(xì)胞片,來構(gòu)建一個(gè)表皮干細(xì)胞短期培養(yǎng)體系,然后,我們用10ng/ml的IL-17A和IL-22體外處理上皮舌24h。用免疫熒光方法檢測(cè)上皮舌的K15和β1整合素表型。結(jié)果表明,不用細(xì)胞因子處理的上皮舌,表達(dá)K15和/或p1整合素的細(xì)胞局限在表皮舌外緣。然而,用IL-17A和IL-22處理后,整個(gè)上皮舌全層都表達(dá)K15和/或β1整合素,并且靠近移植物的內(nèi)層細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)p1整合素。同樣,免疫印跡分析表明,高鈣(1.3mM)和低鈣(0.06mM)狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞用這兩種細(xì)胞因子處理后,K15和β1整合素的表達(dá)與對(duì)照組相比均上調(diào),并且這兩種細(xì)胞因子也存在輕微協(xié)同作用。 研究結(jié)論 銀屑病皮損基底層干細(xì)胞被激活并以不對(duì)稱細(xì)胞分裂方式產(chǎn)生干細(xì)胞和TA細(xì)胞,使其既可通過自我更新維持干細(xì)胞庫(kù)穩(wěn)定又能產(chǎn)生分化細(xì)胞來補(bǔ)充極度擴(kuò)增的TA細(xì)胞群。IL-17A和IL-22能上調(diào)表皮干細(xì)胞K15和p1整合素的表達(dá),對(duì)維持干細(xì)胞表型有協(xié)同作用。這些結(jié)果闡明了過度增殖銀屑病表皮避免干細(xì)胞群被耗竭的一種機(jī)制。因此,抑制過度活化的干細(xì)胞可為銀屑病臨床治療提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：角質(zhì)形成細(xì)胞 有絲分裂 白細(xì)胞介素 干細(xì)胞 銀屑病
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點(diǎn)6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 英文縮略詞表17-18
• 引言18-20
• 第一部分 斑塊型銀屑病皮損干細(xì)胞標(biāo)記蛋白以及增殖、分化相關(guān)蛋白表達(dá)的免疫組化分析20-30
• 第二部分 體內(nèi)脈沖示蹤技術(shù)聯(lián)合免疫組化檢測(cè)IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮炎模型基底層細(xì)胞有絲分裂30-42
• 第三部分 斑塊型銀屑病皮損中不對(duì)稱分裂干細(xì)胞比例測(cè)定42-52
• 第四部分 IL-17A和IL-22上調(diào)培養(yǎng)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞干細(xì)胞52-68
• 全文結(jié)論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 文獻(xiàn)綜述73-84
• 參考文獻(xiàn)80-84
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文情況84-85
• 在讀期間受到的獎(jiǎng)勵(lì)85-86
• 致謝86

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：748365