本文關(guān)鍵詞：表皮干細胞分裂參與銀屑病斑塊皮損持續(xù)增殖的分子機制研究

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【摘要】：研究背景及目的 銀屑病(psoriasis)是一種常見的多基因遺傳,多種因素參與的慢性炎癥性皮膚病。發(fā)病率約為2%,可累及所有種族。臨床上存在難治愈,易復(fù)發(fā)的特點,嚴(yán)重影響患者身心健康。表皮角質(zhì)形成細胞過度增殖以及異常分化是其主要病理特征。很長時間以來,人們在探究銀屑病的發(fā)病機制時,著眼點都放在角質(zhì)形成細胞上,認(rèn)為銀屑病是一種角質(zhì)形成細胞疾病。然而,這種觀點并不能解釋銀屑病病理中淋巴細胞(絕大多數(shù)為T細胞)浸潤,真皮血管改變等特征。隨著免疫因素在銀屑病發(fā)病中的作用越來越清晰,進而提出銀屑病是一種T細胞免疫介導(dǎo)性皮膚病。其中CD4+T淋巴細胞免疫功能異常在其發(fā)病中尤為重要。 近年來,發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細胞亞群Thl7細胞,以高表達IL-17為特征,在銀屑病發(fā)病中的作用已成為研究的熱點。初始T細胞在TGF-p和IL-6的共同作用下通過特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt分化發(fā)育成為Th17細胞�；罨臉渫粻罴毎置诖罅縄L-23,它與Th17細胞表面的IL-23R結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄因子STAT3誘導(dǎo)IL-17A、IL-17F、IL-22等細胞因子的轉(zhuǎn)錄。這些細胞因子與角質(zhì)形成細胞上的相應(yīng)受體IL-17R, IL-22R結(jié)合發(fā)揮炎癥和促進角質(zhì)形成細胞增殖分化的作用。由此可見,銀屑病更是一種角質(zhì)形成細胞和免疫細胞之間相互作用失衡的疾病。然而,對表皮干細胞在銀屑病表皮增殖中的作用及其在持續(xù)增殖狀態(tài)下如何免遭基因組復(fù)制錯誤或突變以維持干細胞群數(shù)目恒定的機制仍知之甚少。 表皮細胞可分為三種亞群,即表皮干細胞(epithelial stem cells; ESCs),短暫擴充細胞(transit amplifying cells; TACs)和有絲分裂后分化細胞(postmitotic cells; PMCs)。ESCs在皮膚穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。大多數(shù)情況下,表皮干細胞處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)受到創(chuàng)傷或理化等因素刺激時,可激活并增殖分化參與皮膚穩(wěn)態(tài)的修復(fù)使表皮始終處于增殖、分化和脫屑狀態(tài),并且增殖與脫屑的速度保持大致平衡。細胞從基底層到達皮膚表面的時間,包括表皮細胞由基底層增殖、分化過渡到棘細胞層以及進一步分化為無完整細胞器結(jié)構(gòu)的角質(zhì)層所需要的時間,稱之為表皮通過時間。正常皮膚的表皮通過時間為52～75天,但在銀屑病這一時間大大縮短,僅8-10天。ESCs通過對稱和不對稱分裂進行增殖。前者多發(fā)生于胚胎發(fā)育過程以增加皮膚表面積或成體皮膚穩(wěn)態(tài)遭遇傷害后的增殖修復(fù)過程中,而后者在使干細胞產(chǎn)生子代干細胞維持自身特性(自我更新)的同時也能產(chǎn)生分化的子代細胞-短暫擴充細胞。短暫擴充細胞經(jīng)過幾次短暫細胞分裂后退出細胞周期進入終末分化程序,且一旦開始便不能逆轉(zhuǎn)。因此不對稱分裂是其維持恰當(dāng)?shù)母杉毎麛?shù)量的一種方式,因而被認(rèn)為是干細胞的典型特征。表皮中的不對稱細胞分裂類型有兩種：一種是紡錘體平行于基底膜,另一種是細胞分裂平面垂直于基底膜。發(fā)生在成體皮膚中的分裂層面和基底膜平行的不對稱分裂模式,兩個子細胞暫時都在基底層,其中一個子細胞可能接受了不等量的調(diào)控整合素分子表達下調(diào)隨后使其脫離基底層的信號。一旦對稱和不對稱分裂的精密調(diào)控被破壞,不僅會導(dǎo)致干細胞數(shù)量的改變,還會促使TA細胞群極度擴增導(dǎo)致皮膚表皮持續(xù)增殖。DNA“不死”鏈(DNAimmortal strands)假說認(rèn)為,成體干細胞(adult stem cells)在分裂過程中,含有相對比較古老的DNA鏈(又被稱作“不死”鏈)的染色體總是被分配給將要成為干細胞的子代細胞,含有相對新合成DNA鏈的染色體被分配給趨向分化并最終衰老死亡的另一個子代細胞。這樣通過“不死”DNA鏈在子代細胞和干細胞中的不對稱分配,使“不死”DNA鏈永遠保留在干細胞中保護其基因組避免可能發(fā)生的復(fù)制錯誤和突變。因此我們推測銀屑病斑塊持續(xù)增殖的原動力可能為1)銀屑病表皮基底層干細胞很可能被激活,以水平和垂直不對稱分裂方式迅速增殖產(chǎn)生大量TA細胞,導(dǎo)致銀屑病表皮TA細胞群極度擴增(圖1-7)；2)銀屑病基底層干細胞在不對稱分裂過程中,總是把含有相對比較古老的DNA鏈(“不死”鏈)的染色體分配給將要成為干細胞的子代細胞,把含有相對新合成DNA鏈的染色體分配給趨向分化并最終衰老死亡的另一個子代細胞(圖2-2),以保護其基因組避免在持續(xù)增殖狀態(tài)下可能發(fā)生的復(fù)制錯誤來保證干細胞群不被耗竭； 表皮終末分化是一個精細調(diào)節(jié)的過程,細胞由基底層向基底淺層遷移是分化過程關(guān)鍵性的第一步,在分化過程的每個階段高度表達特異性角蛋白。在表皮基底層分裂活躍的角質(zhì)形成細胞主要表達干細胞標(biāo)記物角蛋白15(Keratin; K15);當(dāng)角質(zhì)形成細胞移行至棘層時失去分裂能力,便關(guān)閉K15的表達,開啟分化特異性角蛋白K10的表達。 因此,在本研究中,我們用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測了銀屑病斑塊皮損和正常人皮膚中干細胞以及增殖、分化相關(guān)標(biāo)記物,觀察銀屑病斑塊皮損TA細胞群變化；用溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine; BrdU)標(biāo)記IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠,檢測基底層干細胞有絲分裂；用BrdU脈沖示蹤技術(shù)研究人角質(zhì)形成細胞DNA模板鏈分離,觀察比較銀屑病和正常人表皮細胞發(fā)生不對稱分裂的比例；用IL-17A和IL-22處理人角質(zhì)形成細胞和從皮膚移植物邊緣長出的第一代表皮細胞片(epidermal cell sheet),觀察其對分化相關(guān)蛋白表達的影響,以期揭示表皮干細胞活化及其參與銀屑病表皮持續(xù)性增厚的方式和可能涉及的分子機制。 研究方法與結(jié)果 1.斑塊型銀屑病皮損中TA細胞群擴增：用免疫組化技術(shù)檢測銀屑病皮損和正常皮膚標(biāo)本干細胞標(biāo)記蛋白(K15和ITGB1),TA細胞標(biāo)記蛋白(ITGB1),有絲分裂后細胞(PMCs)標(biāo)記蛋白(K10)和細胞增殖標(biāo)記抗原(Ki67)。結(jié)果顯示與正常皮膚相比,銀屑病表皮ITGB1和K15的表達明顯降低,基底淺層細胞Ki67陽性染色比例顯著增加,K10陽性角質(zhì)形成細胞卻延遲出現(xiàn),直到棘層淺層才有陽性染色。 2.IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮炎基底層細胞有絲分裂相觀察：用咪喹莫特乳膏外搽小鼠背部皮膚,每天一次,連續(xù)6天后,小鼠背部皮膚增厚,有紅斑、鱗屑,發(fā)生類似銀屑病樣改變。用BrdU標(biāo)記IMQ誘導(dǎo)的皮炎小鼠,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測其基底細胞有絲分裂的細胞數(shù),結(jié)果表明小鼠皮炎模型中檢測到BrdU標(biāo)記的基底細胞有絲分裂比例為6%,而對照組為幾乎檢測不到。在IMQ處理組,BrdU標(biāo)記基底層細胞存在兩種不對稱細胞分裂方式,水平和垂直細胞分裂。 3.銀屑病與正常人角質(zhì)形成細胞發(fā)生不對稱分裂比例比較：用BrdU脈沖示蹤標(biāo)記方法,檢測原代培養(yǎng)的銀屑病和正常人角質(zhì)形成細胞有絲分裂時DNA模板鏈分離方式。結(jié)果表明,銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞對BrdU標(biāo)記發(fā)生不對稱分離比例(約為10%)比正常表皮細胞(僅3%)高。銀屑病與正常人角質(zhì)形成細胞模板鏈分離和K15表達的關(guān)系比較：用BrdU脈沖示蹤標(biāo)記原代培養(yǎng)的銀屑病和正常人角質(zhì)形成細胞,免疫雙標(biāo)方法檢測BrdU標(biāo)記的模板鏈分離和K15表達。結(jié)果表明,進行不對稱分裂的原代角質(zhì)形成細胞通常把模板鏈(未標(biāo)記鏈)分配到表達K15的子細胞中。銀屑病角質(zhì)形成細胞同時表達K15且不對稱標(biāo)記BrdU(假定為第二輪細胞分裂中的不對稱干細胞分裂)的比例(～13%)比正常增加(P＜0.05)。銀屑病角質(zhì)形成細胞同時表達K15且對稱性標(biāo)記BrdU(假定為第二輪細胞分裂中的干細胞自我更新)的比例(～32%)也比正常增加(P＜0.05)。 4.IL-17A和IL-22對從皮膚移植物邊緣長出的第一代表皮細胞片(epidermal cell sheets)和原代培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細胞,表達增殖、分化相關(guān)抗原的影響：用從皮膚移植物邊緣長出第一代上皮細胞組成的上皮細胞片,來構(gòu)建一個表皮干細胞短期培養(yǎng)體系,然后,我們用10ng/ml的IL-17A和IL-22體外處理上皮舌24h。用免疫熒光方法檢測上皮舌的K15和β1整合素表型。結(jié)果表明,不用細胞因子處理的上皮舌,表達K15和/或p1整合素的細胞局限在表皮舌外緣。然而,用IL-17A和IL-22處理后,整個上皮舌全層都表達K15和/或β1整合素,并且靠近移植物的內(nèi)層細胞強表達p1整合素。同樣,免疫印跡分析表明,高鈣(1.3mM)和低鈣(0.06mM)狀態(tài)下培養(yǎng)的細胞用這兩種細胞因子處理后,K15和β1整合素的表達與對照組相比均上調(diào),并且這兩種細胞因子也存在輕微協(xié)同作用。 研究結(jié)論 銀屑病皮損基底層干細胞被激活并以不對稱細胞分裂方式產(chǎn)生干細胞和TA細胞,使其既可通過自我更新維持干細胞庫穩(wěn)定又能產(chǎn)生分化細胞來補充極度擴增的TA細胞群。IL-17A和IL-22能上調(diào)表皮干細胞K15和p1整合素的表達,對維持干細胞表型有協(xié)同作用。這些結(jié)果闡明了過度增殖銀屑病表皮避免干細胞群被耗竭的一種機制。因此,抑制過度活化的干細胞可為銀屑病臨床治療提供一個潛在的靶點。
【關(guān)鍵詞】：角質(zhì)形成細胞 有絲分裂 白細胞介素 干細胞 銀屑病
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 英文縮略詞表17-18
• 引言18-20
• 第一部分 斑塊型銀屑病皮損干細胞標(biāo)記蛋白以及增殖、分化相關(guān)蛋白表達的免疫組化分析20-30
• 第二部分 體內(nèi)脈沖示蹤技術(shù)聯(lián)合免疫組化檢測IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮炎模型基底層細胞有絲分裂30-42
• 第三部分 斑塊型銀屑病皮損中不對稱分裂干細胞比例測定42-52
• 第四部分 IL-17A和IL-22上調(diào)培養(yǎng)人表皮角質(zhì)形成細胞干細胞52-68
• 全文結(jié)論68-69
• 參考文獻69-73
• 文獻綜述73-84
• 參考文獻80-84
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文情況84-85
• 在讀期間受到的獎勵85-86
• 致謝86

【共引文獻】

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本文編號：748365