發(fā)布時(shí)間：2017-08-24 21:51

  本文關(guān)鍵詞：ACTL6a在正常和銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的作用研究

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【摘要】：[研究背景] 肌動(dòng)蛋白相關(guān)的蛋白(Actin related proteins, Arps)是由一組新近發(fā)現(xiàn)的,高度保守的蛋白分子超家族組成,這些蛋白分子有與傳統(tǒng)的肌動(dòng)蛋白類似的序列,與肌動(dòng)蛋白共同組成了染色質(zhì)重塑酶復(fù)合體。近幾年研究發(fā)現(xiàn)hrps除了作為細(xì)胞骨架的組成成分,還可以影響轉(zhuǎn)錄。核內(nèi)的肌動(dòng)蛋白樣-6a (Actin like6a, ACTL6a,又叫Arp4, BAF53)能夠和組蛋白核心結(jié)合,促進(jìn)染色質(zhì)重塑復(fù)合體和和核小體的結(jié)合,在調(diào)控基因表達(dá),DNA復(fù)制和其它染色質(zhì)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。皮膚表皮是一種在干細(xì)胞自我更新和分化中維持動(dòng)態(tài)平衡的組織,表皮基底層的干細(xì)胞持續(xù)分化形成了棘層,表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白角質(zhì)蛋白-1和角質(zhì)蛋白-10。細(xì)胞繼續(xù)分化,形成了顆粒層,表達(dá)分化蛋白Fi11aggrin和Loricrin。新近的研究發(fā)現(xiàn)ACTL6a是一種在干細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用的因子,條件性的敲除ACTL6a會(huì)引起表皮的終端分化,周期阻滯和分化不全,而過表達(dá)ACTL6a會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞處于前體狀態(tài),抑制細(xì)胞分化。哺乳動(dòng)物的ACTL6a和β-actin作為SWI/SNF樣的BAF染色質(zhì)重塑復(fù)合體,可以通過N端的組蛋白尾的修飾和參與組蛋白-DNA相互作用改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)。ACTL6a還通過拮抗SWI/SNF依賴的KLF4活化以及別的表皮分化相關(guān)基因維持未分化的干細(xì)胞前體狀態(tài)。但是人們對(duì)ACTL6a在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)揮作用的確切機(jī)制還不是很清楚。 組蛋白調(diào)節(jié)酶,染色質(zhì)重塑復(fù)合體,組蛋白的甲基化和乙�；徽J(rèn)為是幫助基因組排列在特定的染色質(zhì)區(qū)域內(nèi)內(nèi)在表觀遺傳學(xué)機(jī)制。尤其是賴氨酸甲基化和染色質(zhì)重塑酶一起在細(xì)胞分化,凋亡和器官形成過程中的染色質(zhì)動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮重要作用。近些年,基因組范圍內(nèi)的甲基化調(diào)節(jié)也被證實(shí)和多種疾病的發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)。銀屑病是一種由多因素引起的與含有表皮干細(xì)胞的基底層靜止細(xì)胞群高度增生相關(guān)的免疫異常性慢性炎癥增生性皮膚病。越來越多的抑癌基因以及免疫相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化已經(jīng)在銀屑病皮損的研究中被發(fā)現(xiàn)。 但是目前為止,還沒有研究探索ACTL6a在正常及銀屑病角質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)表觀遺傳學(xué)過程及細(xì)胞功能中的作用,本文研究對(duì)比了ACTL6a在銀屑病皮膚以及正常皮膚中的表達(dá),并就ACTL6a和異染色質(zhì)蛋白HP1γ的相互作用,ACTL6a在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)作用,在角質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)中的調(diào)節(jié)作用做一研究,為探討ACTL6a參與銀屑病發(fā)病的可能機(jī)制打下基礎(chǔ)。 [目的] 明確ACTL6a和HP1γ在正常皮膚組織和銀屑病皮膚組織中的表達(dá)情況,及相應(yīng)組織來源細(xì)胞中的表達(dá),研究ACTL6a是否還可以通過HP1γ發(fā)揮調(diào)節(jié)核內(nèi)染色質(zhì)重塑的作用；研究ACTL6a高表達(dá)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)甲基化調(diào)節(jié),乙�；{(diào)節(jié),以及一系列分化相關(guān)角質(zhì)蛋白表達(dá)的影響；明確ACTL6a高表達(dá)對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,遷移,衰老,氧化應(yīng)激的作用。 [方法] 第一部分：用組織免疫熒光法對(duì)ACTL6a和HP1佰在正常皮膚組織,銀屑病非皮損區(qū),皮損區(qū),鄰近皮損區(qū)皮膚中的表達(dá)進(jìn)行定位,并用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和免疫印跡法定位,定量檢測(cè)了ACTL6a和HP1γ在正常皮膚組織來源的角質(zhì)形成細(xì)胞,銀屑病非皮損區(qū),鄰近皮損區(qū),皮損區(qū)皮膚組織來源的角質(zhì)形成細(xì)胞中的定位及表達(dá)。 第二部分：使用慢病毒介導(dǎo)的ACTL6a過表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染正常角質(zhì)形成細(xì)胞,提取總RNA和蛋白質(zhì)。以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的ACTL6a的過表達(dá)效率。以細(xì)胞熒光方法和Western-blot檢測(cè)ACTL6a過表達(dá)的角質(zhì)形成細(xì)胞胞核內(nèi)HP1γ的表達(dá)。 第三部分：研究ACTL6a過表達(dá)后組蛋白-3賴氨酸位點(diǎn)甲基化的影響和定位變化,以Western-blot法檢測(cè)ACTL6a高表達(dá)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)組蛋白乙�；挠绊�,探討ACTL6a高表達(dá)細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變。 第四部分：用慢病毒轉(zhuǎn)染正常皮膚組織來源的KCs,檢測(cè)ACTL6a過表達(dá)對(duì)角蛋白K1, K2, K10、K14、K16, Involucrin, Loricrin以及整合素β1、E-cadherin蛋白表達(dá)水平的影響,分別用MTS法,transwe11法,β半乳糖苷酶細(xì)胞衰老試劑盒和氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)ACTL6a過表達(dá)的KCs和正常KCs細(xì)胞增殖能力,遷移能力,細(xì)胞衰老和氧化應(yīng)激的改變。 [結(jié)果] 一、ACTL6a和HP1γ在正常皮膚組織和銀屑病皮膚組織以及細(xì)胞中的表達(dá)： 1)組織免疫熒光：ACTL6a和HP1γ在正常皮膚組織和銀屑病皮損區(qū),臨近皮損區(qū)以及非皮損區(qū)組織中除了角質(zhì)層外的表皮全層均有表達(dá)；ACTL6a在正常皮膚和銀屑病來源的皮膚組織中均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞核表達(dá),但是HP1γ在正常皮膚和銀屑病來源的皮膚組織中的分布模式有所不同。 2) Western-blot:體外培養(yǎng)的銀屑病臨近皮損區(qū)來源的KCs中ACTL6a和HP1γ蛋白的表達(dá)均高于皮損區(qū),非皮損區(qū),以及正常皮膚組織來源的KCs。 3) RT-PCR:體外培養(yǎng)的銀屑病皮損區(qū)組織來源的KCs中ACTL6a的表達(dá)高于正常角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)。 二、 ACTL6a過表達(dá)促進(jìn)HP1γ在KCs核周的聚集。 在正常組織來源的KCs中,HPl y均勻分布于細(xì)胞核內(nèi),在空白質(zhì)粒組HP1γ主要分布在細(xì)胞核中心,而在慢病毒介導(dǎo)的ACTL6a高表達(dá)的KCs細(xì)胞核內(nèi),HP1γ分布集中在核周區(qū)域。但是ACTL6a過表達(dá)的KCs中HP1γ整體蛋白量的表達(dá)與正常KCs相比沒有明顯變化。 三、 ACTL6a過表達(dá)引起組蛋白-3的甲基化調(diào)節(jié)以及組蛋白的乙�；{(diào)節(jié)。 高表達(dá)ACTL6a的KCs中一系列組蛋白-3賴氨酸位點(diǎn)上的整體甲基化水平與正常對(duì)照組KCs相比不同；經(jīng)過ACTL6a慢病毒處理后的KCs核內(nèi)多種組蛋白甲基化的亞細(xì)胞定位也與正常對(duì)照組的KCs不同；過表達(dá)ACTL6a的KCs中乙�；疕istone2a及乙�；疕istone3的水平比對(duì)照組KCs升高,組蛋白去乙酰化酶的水平比對(duì)照組降低。 四、過表達(dá)ACTL6a能改變細(xì)胞分化狀態(tài),引起角質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白K10,K14, Involucrin和Loricrin降低。 五、慢病毒介導(dǎo)的ACTL6a過表達(dá)能增強(qiáng)體外培養(yǎng)的KCs增殖、遷移能力,抑制KCs的衰老和氧化應(yīng)激。 [結(jié)論] 一,在銀屑病皮膚組織和正常皮膚組織中均表達(dá)ACTL6a和HP1γ,ACTL6a在兩種皮膚組織中的分布一致,但HP1γ在兩種皮膚組織中的分布模式不同。 二,ACTL6a和HP1γ在銀屑病來源的角質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)高于正常角質(zhì)形成細(xì)胞。 三、ACTL6a在角質(zhì)形成細(xì)胞中的過表達(dá)促進(jìn)了核內(nèi)HP1γ在核周的重定位。 四、ACTL6a在角質(zhì)形成細(xì)胞中的過表達(dá)調(diào)節(jié)了組蛋白的賴氨酸位點(diǎn)甲基化和組蛋白的乙�；^程。 五、ACTL6a在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)可能與細(xì)胞分化相關(guān),并參與了表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移、衰老、氧化應(yīng)激。 六、銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中高表達(dá)的ACTL6a可能參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制。 七、對(duì)ACTL6a促進(jìn)核內(nèi)HP1γ亞細(xì)胞定位改變的機(jī)制研究不夠深入,以及ACTL6a和HP1γ在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用涉及的具體基因及信號(hào)通路的探討不深入是本項(xiàng)研究的局限。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 英文縮寫注釋15-16
• 目錄16-18
• 研究背景18-28
• 第一部分 ACTL6A在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和銀屑病中的表達(dá)28-44
• 前言28-29
• 材料與方法29-36
• 結(jié)果36-42
• 討論42-43
• 結(jié)論43-44
• 第二部分 ACTL6A過表達(dá)促進(jìn)HP1Γ在核周聚集44-52
• 前言44-45
• 材料與方法45-47
• 結(jié)果47-50
• 討論50-51
• 結(jié)論51-52
• 第三部分 ACTL6A過表達(dá)參與甲基化及乙�；{(diào)節(jié)52-63
• 前言52-53
• 材料與方法53-54
• 結(jié)果54-59
• 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 第四部分 ACTL6A過表達(dá)影響角質(zhì)形成細(xì)胞功能63-74
• 前言63-64
• 材料與方法64-66
• 結(jié)果66-71
• 討論71-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 綜述78-90
• 參考文獻(xiàn)84-90
• 在讀期間科研成果及所獲得獎(jiǎng)勵(lì)90-91
• 在讀期間科研成果及所獲得獎(jiǎng)勵(lì)#@@

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李峰;晉紅中;王寶璽;;北京協(xié)和醫(yī)院銀屑病住院患者中代謝綜合征的患病率調(diào)查[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2010年05期

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本文編號(hào)：733332