本文關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在銀屑病中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 銀屑病 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 Foxo1

【摘要】：目的明確調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells,Treg)在銀屑病發(fā)病中作用,探討Treg細(xì)胞參與銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵分子機(jī)制。方法收集81例銀屑病患者及46例健康人外周血,流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例;分選銀屑病患者及健康人CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞和CD4+CD25-CD127+效應(yīng)T細(xì)胞(T effective cell,Teff),利用淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型研究Treg細(xì)胞增殖能力及免疫抑制功能;通過表達(dá)譜芯片篩選銀屑病患者Treg細(xì)胞差異基因表達(dá),GO聚類分析關(guān)鍵的信號(hào)通路,q PCR和FCM驗(yàn)證表達(dá)的差異基因;根據(jù)篩選分析結(jié)果,q PCR、免疫熒光和Western blot檢測(cè)銀屑病外周血及皮損Treg細(xì)胞功能缺陷關(guān)鍵分子Foxo1和AKT的m RNA、蛋白磷酸化水平及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位;利用健康人及銀屑病患者血清刺激Treg細(xì)胞,免疫熒光和Western blot檢測(cè)AKT和Foxo1的蛋白磷酸化水平及表達(dá)定位;CHIP檢測(cè)Foxo1和T-bet的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況;Foxo1 sh RNA轉(zhuǎn)染健康人Treg細(xì)胞,淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)Treg細(xì)胞的增殖能力及免疫抑制功能,FCM檢測(cè)Treg細(xì)胞中T-bet和IFN-γ表達(dá)水平;利用T細(xì)胞回輸聯(lián)合咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)誘導(dǎo)Rag2-/-小鼠銀屑病樣模型,研究Treg細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用;分選Foxo1敲除小鼠和WT小鼠的Treg細(xì)胞,利用T細(xì)胞回輸聯(lián)合IMQ誘導(dǎo)Rag2-/-小鼠銀屑病模型,明確Foxo1在Treg細(xì)胞參與銀屑病發(fā)病中的作用。結(jié)果銀屑病患者外周中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例與健康人相比無(wú)明顯差異(P=0.1365);且與銀屑病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性(R2=0.2580,P0.001);銀屑病患者Treg細(xì)胞的增殖能力明顯降低,其抑制Teff細(xì)胞活化能力也明顯低于健康人Treg細(xì)胞;表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示銀屑病患者外周血中Treg細(xì)胞表達(dá)大量以IFN-γ為主的促炎因子,將銀屑病患者Treg細(xì)胞的基因表達(dá)譜與Foxo1-/-Treg細(xì)胞的表達(dá)譜比對(duì),發(fā)現(xiàn)Foxo1-/-Treg細(xì)胞中60%的基因表達(dá)變化趨勢(shì)與銀屑病患者Treg細(xì)胞的基因表達(dá)譜一致;q PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀屑病患者Treg細(xì)胞中Foxo1的m RNA水平與健康人相比無(wú)明顯差異,介導(dǎo)Foxo1磷酸化的AKT的m RNA水平明顯高于健康人,Western blot結(jié)果顯示銀屑病患者Treg細(xì)胞中AKT磷酸化水平升高,同時(shí)Foxo1的Thr24位點(diǎn)磷酸化水平明顯升高,Foxo1總量表達(dá)明顯降低;免疫熒光結(jié)果顯示,健康人Treg細(xì)胞中Foxo1主要表達(dá)在胞核內(nèi),而銀屑病患者Treg細(xì)胞中Foxo1大量向胞漿遷移;血清刺激實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與健康人血清相比,銀屑病患者血清能夠明顯抑制Treg細(xì)胞的免疫抑制功能,增加AKT的磷酸化水平,促進(jìn)Foxo1向胞漿遷移,使其失去轉(zhuǎn)錄活性;CHIP的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞中Foxo1可以和T-bet的啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合;利用Foxo1sh RNA抑制健康人Treg細(xì)胞中的Foxo1表達(dá),能夠明顯抑制Treg細(xì)胞增殖能力及免疫抑制功能,促進(jìn)Treg細(xì)胞表達(dá)T-bet和IFN-γ;銀屑病小鼠模型顯示,局部回輸Treg細(xì)胞能夠明顯緩解小鼠銀屑病樣皮損的嚴(yán)重程度,而局部回輸Foxo1-/-Treg細(xì)胞則不能有效緩解實(shí)驗(yàn)小鼠銀屑病樣表型。結(jié)論我們的研究明確了銀屑病存在Treg細(xì)胞功能缺陷,并證實(shí)其在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮重要作用;發(fā)現(xiàn)銀屑病患者異常的免疫微環(huán)境造成Treg細(xì)胞中AKT介導(dǎo)的Foxo1磷酸化水平升高,促進(jìn)Foxo1向細(xì)胞漿遷移,使其轉(zhuǎn)錄活性降低,導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能缺陷。本研究首次證實(shí)Foxo1磷酸化是Treg細(xì)胞功能異常及影響銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵分子機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 Foxo1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-31
• 1. 銀屑病概況16
• 2. T細(xì)胞活化介導(dǎo)銀屑病發(fā)病16-18
• 3. 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞18-24
• 4. Foxo1對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育及功能的調(diào)控作用24-28
• 5. 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與銀屑病發(fā)病28-31
• 1 材料31-40
• 1.1 主要試劑31-33
• 1.2 主要耗材33-34
• 1.3 主要儀器34-36
• 1.4 主要試劑配制方法36-40
• 2 方法40-53
• 2.1 臨床樣本40
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源、鑒定及誘導(dǎo)基因敲除方法40-41
• 2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離41
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和復(fù)蘇41-42
• 2.5 小鼠脾臟單細(xì)胞懸液制備42
• 2.6 銀屑病小鼠模型建立42
• 2.7 流式細(xì)胞分析42-43
• 2.8 流式細(xì)胞分選43
• 2.9 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制功能43-44
• 2.10 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖功能44
• 2.11 慢病毒轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)性T細(xì)胞模型44-45
• 2.12 血清刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞模型45
• 2.13 RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄45-46
• 2.14 擴(kuò)增PCR及瓊脂糖凝膠電泳46
• 2.15 實(shí)時(shí)熒光定量PCR46-48
• 2.16 蛋白提取及Western Blot48-49
• 2.17 石蠟切片和HE切片染色49-50
• 2.18 冰凍切片制備50
• 2.19 免疫熒光50-51
• 2.20 染色質(zhì)共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，，CHIP）51-52
• 2.21 統(tǒng)計(jì)方法52-53
• 3 結(jié)果53-70
• 3.1 銀屑病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量比例無(wú)明顯異常53-54
• 3.2 銀屑病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖能力低下54-55
• 3.3 銀屑病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能減弱55-56
• 3.4 銀屑病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞異常表達(dá)Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子56-59
• 3.5 銀屑病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞AKT - Foxo1通路過度激活59-62
• 3.6 銀屑病患者血清促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞AKT - Foxo1通路激活62-63
• 3.7 Foxo1通過T-bet - IFN-γ 通路影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能63-65
• 3.8 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞回輸能夠緩解IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣表型65-68
• 3.9 Foxo1缺陷的Treg細(xì)胞不能有效緩解小鼠銀屑病樣表型68-70
• 4 討論70-78
• 小結(jié)78-79
• 參考文獻(xiàn)79-90
• 附錄90-92
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果92-94
• 致謝94

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本文編號(hào)：675189