本文關(guān)鍵詞：臨床分離的紅色毛癬菌肉芽腫株生物學(xué)性狀及毒力的初步研究

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【摘要】：皮膚癬菌是一類寄生于人類以及動物皮膚淺層角蛋白組織的絲狀真菌。目前己報(bào)告的皮膚癬菌大約有45種,其中部分僅能感染動物,尚未證明可以侵犯人體。對人類有致病作用的大概有20余種。按照菌落特征及大分子孢子的形態(tài),皮膚癬菌可分為3屬：毛癬菌屬,表皮癬菌屬及小孢子菌屬。皮膚癬菌引起的體癬、股癬、甲癬等淺部感染在全世界范圍內(nèi)流行,具有極高的發(fā)病率和患病率。紅色毛癬菌是最主要的致病皮膚癬菌,有報(bào)道稱臨床上一半以上體癬、90%以上的股癬和手足癬由紅色毛癬菌引起。近年有研究表明糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用等以及外傷、局部放療、長期外用糖皮質(zhì)激素類藥物是引發(fā)紅色毛癬菌深部感染的易感因素,紅色毛癬菌可以引起膿癬、膿腫和肉芽腫等皮膚及皮下組織感染�，F(xiàn)在國內(nèi)外對紅色毛癬菌肉芽腫株的研究大多為單個病例報(bào)道,主要集中在紅色毛癬菌深部感染的分類、特殊臨床表現(xiàn)、疾病誘發(fā)因素以及病原學(xué)來源等,尚缺乏對紅色毛癬菌肉芽腫菌株的相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)第一部分?jǐn)M對分離自我科的三例癬菌性肉芽腫患者的紅色毛癬菌菌株進(jìn)行生物學(xué)性狀及基因分型研究,并與分離自淺表感染的菌株進(jìn)行比較,了解紅色毛癬菌肉芽腫菌株的微生物學(xué)特征,為進(jìn)一步研究其致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。紅色毛癬菌引發(fā)的深部感染不僅需要系統(tǒng)性抗真菌治療,而且治療時間長且易復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。為了更好地治療皮膚癬菌病,皮膚癬菌病的動物模型在評估抗菌藥物的療效中發(fā)揮了重要作用�，F(xiàn)在關(guān)于皮膚癬菌動物模型大多用須癬毛癬菌,而紅色毛癬菌為親人性皮膚癬菌,動物模型的構(gòu)建相對困難,并且有關(guān)紅色毛癬菌和宿主間的相互影響機(jī)制現(xiàn)在也尚不清楚。近年來國內(nèi)學(xué)者在糖皮質(zhì)激素干預(yù)下,在豚鼠背部建立了紅色毛癬菌淺表感染模型,但是關(guān)于紅色毛癬菌導(dǎo)致深部感染的動物模型目前尚沒有相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)第二部分?jǐn)M利用分離來自紅色毛癬菌肉芽腫患者的菌株,采用注射足墊的方法,構(gòu)建紅色毛癬菌肉芽腫動物模型,為進(jìn)一步探討紅色毛癬菌引起深部感染的發(fā)病機(jī)制、感染后免疫和病理過程及紅色毛癬菌治療藥物療效的評價提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1紅色毛癬菌肉芽腫株和淺表感染株的生物學(xué)性狀和基因型的比較研究1.1目的研究紅色毛癬菌肉芽腫株和淺表感染臨床株生物學(xué)性狀和基因型。1.2對象和方法對象：收集南京總醫(yī)院皮膚科門診2013年4月-2015年5月就診的3例紅色毛癬菌肉芽腫患者和2015年4月就診的11例淺表感染患者的臨床分離菌株。紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCCMYA4438和須癬毛癬菌CMCC(F)T5a(由衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏管理中心真菌中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所贈送)。方法：(1)將臨床分離菌株進(jìn)行純化,傳代,然后接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,置于27℃培養(yǎng)箱下,培養(yǎng)10天。觀察菌落外觀、質(zhì)地及背面顏色。采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)對分離菌株進(jìn)行鑒定。(2)將全部分離株接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,28℃孵育7 d挑取紅色毛癬菌菌落置入研磨器中,加入生理鹽水,研磨后制成均勻菌懸液,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×107CFU/mL。(3)將肉芽腫株和標(biāo)準(zhǔn)株菌ATCCMYA4438懸液以移液槍取10μL菌懸液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中,每株接種18個,分別置于25℃27℃、 35℃、37℃、39℃、41℃各3個。淺表感染分離株菌懸液30株以移液槍取10μL菌懸液接種于PDA平板中,每株接種6個,分別置于27℃、37℃下各3個逐日觀察比較菌落形態(tài)大小變化,觀察3周,拍照并測量記錄下14天和21天時菌落最外直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次,取平均值。(4)按照美國國家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的M38-A2方案采用微量液體稀釋法在體外進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在含抗真菌藥物的96孔板的1-11列孔加入2倍終濃度的菌懸液,270C溫箱孵育,7天后觀察結(jié)果。4種抗真菌藥物為伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑。檢測分離株最低抑菌濃度(MIC),以ATCCMYA4438為質(zhì)控株。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作至少3次,取平均值。(5)用Bi-opsin真菌基因組DNA提取試劑盒按照說明提取菌株DNA,對菌株TRS-1 (NTS區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)亞單位1)、TRS-2區(qū)(NTS區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)亞單位2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定菌株基因型。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測：用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠程序系統(tǒng)中觀察結(jié)果,并采集保存圖像,剩余肉芽腫株P(guān)CR產(chǎn)物送Invitrogen貿(mào)易有限公司測序,測序結(jié)果與genebank基因序列比對分析。(6)采用SPSS20軟件,運(yùn)用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析和配對樣本t檢驗(yàn)分本析對菌落直徑數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.3結(jié)果(1)菌株鑒定結(jié)果3株肉芽腫患者臨床分離株經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒定為紅色毛癬菌。11株淺表感染患者臨床分離株經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)均鑒定為紅色毛癬菌。(2)紅色毛癬菌溫度試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析,紅色毛癬菌肉芽腫株3株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC4438菌株和溫度都有差異(P0.05、P0.05)。14天、21天標(biāo)準(zhǔn)株ATCC4438在25℃、27℃培養(yǎng)條件下菌落直徑大于其在35℃、37℃培養(yǎng)條件下的菌落直徑,三株肉芽腫菌株在35℃、37℃、27℃三個溫度條件下菌落直徑均無差異(P0.05),39℃、41℃下肉芽腫株不生長。11株淺部感染分離株在27℃培養(yǎng)條件下菌落直徑均大于其在37℃培養(yǎng)條件下的菌落直徑(P0.05)。(3)體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果肉芽腫株和淺部感染株對伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的MIC值均在正常范圍內(nèi),無耐藥株出現(xiàn)。(4)基因型分析結(jié)果TRS-1區(qū)根據(jù)條帶不同分為4型,NJT001、淺2、淺4、淺7、淺10為type1型；NJT002、ATCC4438.淺3、淺5、淺6、淺9、淺11為type2型：淺1為type3型；NJT003、淺8為type4型。TRS-2區(qū)根據(jù)條帶不同可分為2型,肉芽腫株和標(biāo)準(zhǔn)株均在500bp處形成條帶,僅有淺5在400bp左右條帶。NJT001TRS-1區(qū)序列長441bp,與GenBank中紅色毛癬菌(AF222889)有1個堿基差異；TRS-2區(qū)序列長508bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有3個堿基差異。NJT002 TRS-1區(qū)序列長605bp,與GenBank中紅色毛癬菌(AF222887)有16個堿基差異,TRS-2區(qū)序列長509bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有3個堿基差異。NJT003 TRS-1區(qū)序列長898bp,與GenBank中紅色毛癬菌(JX431933)有19個堿基差異,TRS-2區(qū)序列長508bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有2個堿基差異。1.4結(jié)論紅色毛癬菌肉芽腫株的鑒定需要病理學(xué)和分子生物學(xué)等才能明確鑒定。本文中紅色毛癬菌肉芽腫株較淺表感染分離株更耐熱,肉芽腫株和淺表分離株對伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的敏感性無差異,均未發(fā)生耐藥。肉芽腫株和淺表分離株基因分型無差異。3株肉芽腫菌株TRS-1區(qū)序列與GenBank中的紅色毛癬菌分別有1、3和19個堿基差異,TRS-2區(qū)序列與GenBank中的紅色毛癬菌分別有2-3個堿基差異,從而推測三例肉芽腫菌株可能是紅色毛癬菌的一個變種。2紅色毛癬菌感染BalB/C鼠肉芽腫模型的構(gòu)建2.1目的紅色毛癬菌不僅引起皮膚淺部感染還可引起深部感染,但相關(guān)動物模型未見研究報(bào)道。本部分?jǐn)M構(gòu)建紅色毛癬菌感染的癬菌性肉芽腫模型。2.2對象和方法對象：紅色毛癬菌肉芽腫分離株3株,來自2013年4月到2015年5月南京總醫(yī)院皮膚科門診的3位紅色毛癬菌肉芽腫患者組織,分離自體癬患者的體癬株2株,菌株均經(jīng)傳統(tǒng)方法的分離培養(yǎng)并經(jīng)分子生物學(xué)鑒定,依次命名為NJT001-NJT003.淺1和淺2。紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCCMYA4438(由衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏管理中心真菌中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所贈送,分離自美國患者趾甲)。方法(1)普通級健康BalB/C小鼠52只,隨機(jī)分為13籠,4只小鼠置于1籠,編號為1-13。將13籠小鼠分為3組,第1組為空白對照組(為第1籠,不接種紅色毛癬菌)；第2組為PBS菌懸液組,第2-7籠,依次接種NJT001、NJT002、 NJT003、淺1、淺2和ATCCMYA4438紅色毛癬菌PBS菌懸液。第3組為實(shí)驗(yàn)組,第8-13籠,依次接種NJT001、NJT002、NJT003、淺1、淺2和ATCCMYA4438紅色毛癬菌黏液素菌懸液。(2)除空白對照組外,接種前7d開始,每日1次給予地塞米松磷酸鈉注射液25mg.kg-1·d-1腹腔注射BalB/C鼠。將實(shí)驗(yàn)菌株制成無菌的PBS和無菌的黏液素溶液(5g/100m1)菌絲段(含分生孢子)懸液,在細(xì)胞計(jì)數(shù)板下調(diào)整菌絲段／孢子濃度為1×108/ml待用。(3)接種時對小鼠足墊進(jìn)行常規(guī)消毒,用1ml注射器吸取上述菌懸液,向小鼠一只足墊中注射0.2m1菌懸液,另一只作為陰性對照�？瞻讓φ战M注射0.2m1生理鹽水。(4)各組動物給予地塞米松磷酸鈉注射液25 mg.kg-1·d-1腹腔注射,每天注射1次,共21次。每天觀察實(shí)驗(yàn)動物接種處皮膚腫脹破潰變化。接種后第21天處死動物,取接種處皮膚膿液涂片進(jìn)行直接鏡檢,同時將病變組織接種于含氯霉素和放線菌酮的PDA培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱27℃下培養(yǎng)。動物處死后,剪取接種處全層皮膚組織,中性甲醛固定,石蠟包埋切片,分別行HE染色和PAS染色。2.3結(jié)果(1)大體變化 空白組、PBS菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后足墊注射菌懸液后出現(xiàn)腫脹,一周后腫脹逐漸消退,兩周后腫脹完全消退,與陰性對照無異。實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠足墊注射菌懸液后出現(xiàn)腫脹,腫脹持續(xù)不消退,接種后第15天開始,小鼠足墊出現(xiàn)破潰和膿腫。直至動物處死,膿腫和破潰持續(xù)存在,無愈合傾向。(2)直接鏡檢結(jié)果 直接鏡檢可見實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠足墊膿液中存在細(xì)長菌絲,而空白組、PBS菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足墊接種處均沒有膿液,故取組織加等滲鹽水研磨后進(jìn)行直接鏡檢,均未見菌絲和孢子。(3)組織培養(yǎng)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠組織接種平板培養(yǎng)7天后,可見菌落生長,且與接種前菌落形態(tài)基本相同。小培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒定證實(shí)與接種菌株相同。而空白組、PBS菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠組織培養(yǎng)21d后均未見真菌生長。(4)組織病理結(jié)果HE染色下空白組、PBS菌懸液組、實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足部組織未見肉芽腫組織形成,實(shí)驗(yàn)組NJT001、 NJT002和NJT003處理后小鼠足部組織可見表皮角化過度,真皮內(nèi)肉芽腫形成,內(nèi)含中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量炎細(xì)胞浸潤,同時還可見大片壞死區(qū)域。PAS染色下空白組、PBS菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足部組織真表皮內(nèi)未見到菌絲和孢子,在實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002和NJT003處理后小鼠組織中可見到真皮內(nèi)大量細(xì)長分隔菌絲。2.4結(jié)論利用臨床分離的紅色毛癬菌肉芽腫菌株,經(jīng)黏液素和糖皮質(zhì)激素干預(yù)后可以構(gòu)建小鼠紅色毛癬菌肉芽腫模型。
【關(guān)鍵詞】：紅色毛癬菌肉芽腫株 菌落直徑 基因分型 肉芽腫模型 BalB/C鼠
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R756
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-22
• 第一章 紅色毛癬菌肉芽腫株和淺部感染株的生物學(xué)性狀和基因型的比較研究22-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-32
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-37
• 4 討論37-40
• 5 結(jié)論40-41
• 第二章 紅色毛癬菌感染BalB/C鼠肉芽腫模型的構(gòu)建41-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 4 討論49-52
• 5 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 綜述56-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 附錄65-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文66-67
• 致謝67-69

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Kobayashi M.;Ishida E.;YasudaH. ;李政霄;;紅色毛癬菌引起的深在囊狀癬[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(皮膚病學(xué)分冊);2006年04期

2 李喬 ,楊國玲 ,劉維達(dá) ,李朝軍;紅色毛癬菌的基因分型研究[J];中華皮膚科雜志;2002年05期

3 樊建峰,李恒進(jìn),索繼江,李若瑜,萬U，

本文編號：674601