本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體的基因分型與臨床耐藥及診斷研究

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【摘要】：研究背景據(jù)WHO估計(jì),近年來(lái)全世界每年約有1,060萬(wàn)梅毒新發(fā)病例。我國(guó)梅毒的報(bào)告感染率和發(fā)病率也呈直線上升趨勢(shì),2015年度全國(guó)梅毒報(bào)告發(fā)病數(shù)為458,682例,較2011年增長(zhǎng)16%。因此,對(duì)梅毒進(jìn)行有效的監(jiān)控及防治已成為我國(guó)乃至全球公共衛(wèi)生普遍關(guān)注的重點(diǎn)。對(duì)梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)進(jìn)行基因分型不僅能揭示梅毒傳播的規(guī)律,還能從分子水平區(qū)分不同的菌株型別,判定梅毒患者的感染狀態(tài),了解不同型別與特定臨床癥狀的關(guān)系。當(dāng)前,各國(guó)學(xué)者普遍采用的梅毒分型方法是arp/tpr/tp0548三基因分型法,該分型系統(tǒng)穩(wěn)定、鑒別能力強(qiáng),是開展梅毒流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。耐藥是導(dǎo)致梅毒患者臨床治療失敗的主要因素。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的耐紅霉素、阿奇霉素的Tp菌株逐年增加,因此開展本地區(qū)Tp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性監(jiān)測(cè)具有重要的臨床意義。與阿奇霉素不同,目前還未見有Tp耐多西環(huán)素的報(bào)道,但作為疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦的治療梅毒二線用藥,已明確提出有必要對(duì)Tp多西環(huán)素耐藥性進(jìn)行監(jiān)控。在《中國(guó)預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃(2010-2020年)》白皮書中,我國(guó)梅毒控制主要措施就包括提高梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量及加強(qiáng)梅毒篩查力度。目前,血清學(xué)試驗(yàn)作為梅毒診斷的主要依據(jù),但均存在局限性。PCR作為一種有力的診斷手段,近十多年來(lái),基于PCR的梅毒檢測(cè)方法報(bào)道較多,該方法在檢測(cè)梅毒下疳分泌物時(shí),有較好的敏感性和特異性,而當(dāng)檢測(cè)血液及其他標(biāo)本時(shí),盡管有很好的特異性,但因敏感性較低,從而限制了該方法在臨床上的應(yīng)用,因而建立一種敏感性及特異性高的梅毒核酸檢測(cè)方法十分必要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是近年來(lái)一種新型核酸檢測(cè)技術(shù),具有簡(jiǎn)單、高效快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),可多種方式判定結(jié)果,并且能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,在疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有非常廣闊的前景。研究目的本研究對(duì)湖南幾個(gè)主要城市的Tp流行株進(jìn)行分子分型并對(duì)23S rRNA和16S rRNA上耐藥位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),揭示湖南地區(qū)的Tp流行型別及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和多西環(huán)素的耐藥現(xiàn)狀,為本地區(qū)梅毒的監(jiān)控和防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。建立Tp DNA的LAMP檢測(cè)方法,并初步探索該方法在二期梅毒診斷中的應(yīng)用價(jià)值。研究方法收集湖南部分城市(衡陽(yáng)、長(zhǎng)沙、岳陽(yáng)、常德、郴州、永州)二期及潛伏梅毒患者2,253份全血樣本,分別以pol A、tpp47、bmp和tp0319為靶基因?qū)γ范净颊呷獦颖具M(jìn)行PCR篩選,任一靶基因陽(yáng)性樣本被認(rèn)定為含有Tp DNA,將作為下一步研究樣本。以arp、tpr和tp0548作為分型靶基因分別對(duì)篩選出的陽(yáng)性樣本進(jìn)行擴(kuò)增,確定arp基因重復(fù)序列數(shù)目;分析tpr基因RFLP型別;比對(duì)tp0548基因序列,確定型別。結(jié)合三個(gè)基因的型別確定全血樣本中Tp DNA亞型。采用nPCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性標(biāo)本中Tp 23S rRNA,23S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化后分別用限制性內(nèi)切酶MboⅡ和BsaⅠ酶切,凝膠電泳觀察結(jié)果;純化產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)。采用nPCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性標(biāo)本Tp 16S rRNA,陽(yáng)性產(chǎn)物純化后測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)。選取bmp作為靶基因,建立Tp-LAMP方法,擴(kuò)增一系列10倍稀釋的Tp Nichols株DNA,評(píng)價(jià)其靈敏度;以鉤端螺旋體、伯氏螺旋體及常見臨床菌株為對(duì)照,評(píng)價(jià)其特異性;檢測(cè)二期梅毒患者及健康獻(xiàn)血者全血樣本,初步評(píng)價(jià)LAMP的臨床應(yīng)用。研究結(jié)果常規(guī)PCR篩選2,253例梅毒全血標(biāo)本,靶基因pol A、tpp47、bmp和tp0319的陽(yáng)性率分別為18.8%(423/2,253)、18.4%(415/2,253)、17.5%(395/2,253)和14.2%(321/2,253),共篩選出455例Tp DNA陽(yáng)性標(biāo)本。采用降落PCR從455例PCR陽(yáng)性樣本中擴(kuò)增出203例arp基因,得到8種型別,其中以14個(gè)重復(fù)序列最為常見(62.6%,127/203);采用nPCR擴(kuò)增tpr基因,獲得385例陽(yáng)性產(chǎn)物,經(jīng)Mse I酶切后,RFLP分析tpr基因得到8種型別,其中以d型為主(62.1%,239/385);采用nPCR擴(kuò)增tp0548基因,擴(kuò)增出381例,PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與公布的參考序列進(jìn)行比對(duì),得到4個(gè)型別,分別為f、a、c和g型。組合arp/tpr/tp0548均陽(yáng)性的樣本,188例樣本能完全分型,可分為32個(gè)亞型,其中以14d/f亞型為主,占36.5%,其余的主要亞型分別為14a/f、14e/f、12e/f、12d/f、6d/f、11d/f、14j/f、8d/f、14d/a、14p/f、14d/c、14l/f、14e/a、14a/c、12d/a、5d/f、14b/f、6d/a、11o/f、12e/a、14d/g、14e/c、14a/a和14b/f。nPCR分別擴(kuò)增23S rRNA和16S rRNA基因,455例PCR篩選陽(yáng)性標(biāo)本中分別擴(kuò)增出400例23S rRNA基因,438例16S rRNA基因。經(jīng)酶切和測(cè)序分析23S rRNA基因,有390例樣本發(fā)生A2058G突變,其中二期梅毒占260例,潛伏梅毒占130例;未發(fā)現(xiàn)A2059G突變。16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析后,尚未發(fā)現(xiàn)G1058C突變。建立Tp-bmp-LAMP方法,檢測(cè)一系列10倍稀釋的Tp Nichols DNA模板,靈敏度達(dá)4.3×100拷貝數(shù)/μL數(shù)量級(jí),而傳統(tǒng)bmp-PCR法檢測(cè)限為4.3×102拷貝數(shù)/μL;檢測(cè)對(duì)照菌株和健康者血液時(shí)Tp-bmp-LAMP法和常規(guī)bmp-PCR法均為陰性;在檢測(cè)603例二期梅毒患者血液標(biāo)本時(shí),Tp-bmp-LAMP檢出503例,敏感性、特異性分別為83.4%和100%。結(jié)論1)pol A,tpp47和bmp可作為核酸檢測(cè)(NAT)的候選靶基因。2)2013~2015年湖南地區(qū)Tp流行株有32個(gè)基因亞型,其中以14d/f為主要流行型別。3)在湖南地區(qū)梅毒螺旋體流行株存在高頻率23S rRNA基因A2058C點(diǎn)突變,臨床上在治療梅毒時(shí),需謹(jǐn)慎使用大患內(nèi)酯類抗生素。4)在湖南地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)Tp 16S rRNA基因G1058C點(diǎn)突變,多西環(huán)素可作為梅毒二線用藥,但需密切隨訪,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)該突變位點(diǎn)。5)Tp-bmp-LAMP可與血清學(xué)結(jié)合用于二期梅毒的診斷。
【關(guān)鍵詞】：梅毒 分子分型 二期梅毒 潛伏梅毒 耐藥性 突變 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R759.1
【目錄】：

• 主要中英文縮寫索引6-8
• 中文摘要8-13
• Abstract13-20
• 前言20-28
• 第一部分 Tp DNA陽(yáng)性全血標(biāo)本篩選與基因分型28-58
• 第一章 Tp DNA陽(yáng)性全血樣本的篩選29-41
• 1、實(shí)驗(yàn)材料與方法30-35
• 2、結(jié)果35-38
• 3、討論38-40
• 4、結(jié)論40-41
• 第二章 Tp的分子分型41-58
• 1、實(shí)驗(yàn)材料與方法42-50
• 2、結(jié)果50-53
• 3、討論53-57
• 4、結(jié)論57-58
• 第二部分 Tp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類及四環(huán)素類抗生素的突變與耐藥58-80
• 第一章 Tp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的突變與耐藥59-71
• 1、實(shí)驗(yàn)材料與方法60-66
• 2、結(jié)果66-69
• 3、討論69-70
• 4、結(jié)論70-71
• 第二章 Tp對(duì)多西環(huán)素的突變與耐藥71-80
• 1、實(shí)驗(yàn)材料與方法72-76
• 2、結(jié)果76-77
• 3、討論77-79
• 4、結(jié)論79-80
• 第三部分 LAMP技術(shù)在臨床梅毒診斷中的應(yīng)用80-100
• 1、實(shí)驗(yàn)材料與方法81-89
• 2、結(jié)果89-94
• 3、討論94-98
• 4、結(jié)論98-100
• 參考文獻(xiàn)100-112
• 文獻(xiàn)綜述112-128
• 參考文獻(xiàn)119-128
• 攻讀學(xué)位期間的科研成果128-130
• 致謝130

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：580057