本文關(guān)鍵詞：促進毛乳頭細胞體外增殖的新方法：P21的基因沉默

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【摘要】：目的：毛囊是一種哺乳動物特有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的皮膚附屬器官，富含干細胞，由神經(jīng)外胚層和中胚層交互作用形成的一個典型再生系統(tǒng)，它能誘導(dǎo)毛干和毛纖維的產(chǎn)生，其主要包含來源于間充質(zhì)的毛乳頭細胞(Dermalpapilla cells, DPCs)及真皮鞘細胞。毛乳頭細胞位于毛囊基地部，體內(nèi)外誘導(dǎo)毛囊形成及促進毛發(fā)生長是其最重要的生物學(xué)特性，并在毛囊的發(fā)生、發(fā)展和周期性循環(huán)中起主導(dǎo)作用，且體內(nèi)外誘導(dǎo)毛囊形成及促進毛發(fā)生長是DPCs最重要的生物學(xué)功能。但是研究表明只有早期DPCs具有毛囊誘導(dǎo)能力，晚期DPCs細胞則失去這種功能。體外培養(yǎng)早期DPCs展現(xiàn)出凝集性生長特性，但隨著傳代次數(shù)不斷增加，細胞逐漸衰老，這一特性也逐漸喪失。因此，研究者認為DPCs凝集性生長特性可能與其誘導(dǎo)毛囊形成的生物學(xué)功能有關(guān)。目前對于體外培養(yǎng)的DPCs逐漸喪失凝集性生長特性及生物學(xué)功能的原因及機制尚不清楚，值得進一步研究。細胞衰老即細胞過于老化時，可抑制細胞分裂并導(dǎo)致細胞自然死亡過程。研究認為P21(即CDKN1A)作為細胞周期蛋白激酶的廣譜抑制因子能夠誘導(dǎo)細胞老化的多效性調(diào)節(jié)劑-酰胺酶，并影響細胞衰老的許多過程，是細胞衰老過程中的關(guān)鍵基因。本實驗通過腺病毒感染DPCs來沉默P21基因，并檢測細胞的形態(tài)、增殖、周期及凋亡等變化情況，以研究P21在DPCs中的表達及其作用，并探索P21與其生物學(xué)功能是否有相關(guān)性。 方法： 1實驗分組： 正常組：常規(guī)傳代培養(yǎng)。 陰性對照組：用腺病毒HK-1p2shRNA，即空載體腺病毒感染DPCs，以排除空載體腺病毒本身的干擾。 陽性對照組：用腺病毒CDKN1A-1p2shRNA，即沉默P21基因的腺病毒感染DPCs。 2毛乳頭細胞的培養(yǎng)及腺病素轉(zhuǎn)染。將三組毛乳頭細胞一同培養(yǎng)于MSCM培養(yǎng)基中，置于溫箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。并應(yīng)用熒光顯微鏡檢測腺病毒轉(zhuǎn)染效率。 3對比三組毛乳頭細胞的形態(tài)改變及生物學(xué)功能。 4應(yīng)用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。 5應(yīng)用MTT的方法繪制細胞的生長曲線。 6應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞的細胞周期及凋亡。 7應(yīng)用流式細胞術(shù)、免疫組化及免疫熒光三種方法檢測P21蛋白在細胞中的表達情況。 8應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR及實時熒光定量PCR的方法檢測細胞中P21基因mRNA的表達情況。 9應(yīng)用SPSS16.0，以α=0.05的檢驗標準對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及處理。 結(jié)果: 1體外成功培養(yǎng)人毛乳頭細胞至13代，人毛乳頭細胞腺病毒轉(zhuǎn)染HK-1p2shRNA和CDKN1A-1p2shRNA的轉(zhuǎn)染效率達到80-90%。 2正常組：低代次細胞展現(xiàn)明顯的凝集性生長特性，8代開始消失，隨著傳代次數(shù)增加，細胞體積變大，形態(tài)變不規(guī)則，胞質(zhì)顆粒增多；同代次陰性對照組細胞凝集性生長特性及細胞形態(tài)無明顯變化；同代次陽性對照組細胞凝集性生長惡性無明顯變化，但細胞體積稍變大，胞質(zhì)顆粒增多。 3掃描電鏡中陽性對照組細胞的細胞核核分葉增多，核顆粒增多。 4MTT法繪制三種毛乳頭細胞的生長曲線顯示:正常組中4、7、10及12代細胞生長速度依次減慢，而同代次陽性對照組細胞較正常組細胞生長速度增快。 5流式細胞術(shù)檢測毛乳頭細胞的細胞周期及凋亡。 細胞G1期比例用百分比表示，細胞凋亡用%Gated值表示。流式結(jié)果顯示：正常組4代、7代及10代毛乳頭細胞G1期比例分別為：39.7667%±6.7575%、53.9667%±3.0271%及61.4667%±0.6028%，，細胞凋亡率分別為：2.12±0.4232、5.6433±1.3503及10.54±2.1345；而5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞的G1期比例分別為：47.9333%±9.7285%、51.7%±7.494%及40.1%±6.3095%，凋亡率分別是：3.3767±0.8769、7.3567±0.4387及12.3233±1.769；8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞的G1期比例分別為:55.5333%±1.9858%、58.8667%±4.6801%及44.9667%±7.9689%，凋亡率分別是：9.4067±0.9463、13.6967±0.8838及17.9567±3.2875。 6流失細胞術(shù)檢測毛乳頭細胞P21蛋白的表達量用熒光指數(shù)（FI）表示，流式結(jié)果示：正常組4、7、10代毛乳頭細胞中P21蛋白的FI值分別為：2.0825±0.1923、2.4945±0.135、2.8298±0.071；5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21蛋白的FI值分別為：2.2546±0.0363、2.35±0.127及2.0278±0.1443；8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21蛋白的FI值分別為：2.5947±0.1184、2.683±0.1984及2.4019±0.1048。 免疫組化的結(jié)果顯示P21蛋白定位于毛乳頭細胞的細胞核及細胞質(zhì)，而陽性對照組毛乳頭細胞P21蛋白定位于細胞核及核周圍區(qū)域。 免疫熒光的結(jié)果顯示正常組10代毛乳頭細胞胞質(zhì)內(nèi)P21蛋白表達量明顯多于4代及7代細胞。 7反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示陽性對照組毛乳頭細胞的P21基因mRNA表達降低；實時熒光定量PCR結(jié)果示：正常組4、7、10代毛乳頭細胞P21基因mRNA表達量分別為：1、4.8787±0.8342及33.2018±2,536；5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21基因mRNA表達量分別為：1、2.7617±0.9544及0.0609±0.0342；8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21基因mRNA表達量分別為:1、9.3697±4.9706及0.0640±0.0305。 結(jié)論： 1P21可參與調(diào)節(jié)毛乳頭細胞的衰老過程。 2P21可抑制毛乳頭細胞增殖，從而引起毛乳頭細胞生長阻滯。 3P21可引起毛乳頭細胞細胞周期阻滯，抑制毛乳頭細胞由G1向S期過渡。 4P21可抑制毛乳頭細胞的細胞凋亡。 5沉默P21基因有可能作為促進毛乳頭細胞增殖的新方法。
【關(guān)鍵詞】：毛乳頭 P21 毛囊 病毒轉(zhuǎn)染 基因沉默
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R758.7
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料和方法12-21
• 結(jié)果21-26
• 附圖26-33
• 附表33-36
• 討論36-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻42-47
• 綜述 毛乳頭細胞的研究進展47-64
• 參考文獻55-64
• 致謝64-65
• 個人簡歷65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王繼文,宋志強,楊希川,麥躍,郝飛;毛乳頭細胞凝聚性生長差異表達基因的篩選及HSPC016全長克隆的生物信息學(xué)分析[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年18期

本文編號：548719