本文關(guān)鍵詞：UVA輻射聯(lián)合鴉膽子苦醇誘導(dǎo)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:黑色素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤。盡管已有長(zhǎng)期且廣泛的研究,但由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)、過表達(dá)多種耐藥性蛋白及有效的DNA修復(fù)機(jī)制等多種復(fù)雜表型,且轉(zhuǎn)移速度快,惡性程度高,對(duì)化療放療均不敏感等特性使其難以治愈。65%的黑色素瘤患者存在BRAF基因突變,所以目前治療黑色素瘤的研究熱點(diǎn)是研發(fā)針對(duì)BRAF突變的靶向藥物(如vemurafenib和dabrafenib)。這些藥物在短期內(nèi)具有較好的藥效,但不到一年患者體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生耐藥性。基于惡性黑色素瘤的耐藥性現(xiàn)狀,我們嘗試選擇癌細(xì)胞中另一種重要的超表達(dá)耐藥性基因—轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(NF-E2 related factor 2)作為切入點(diǎn),Nrf2在細(xì)胞防御保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。鴉膽子苦醇(brusatol)作為一種獨(dú)特的Nrf2抑制劑可協(xié)助化療藥物治療肺癌,但其在惡性黑色素瘤細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)及聯(lián)合光療如UVA治療惡性黑色素瘤等方面尚未有報(bào)道。目的:采用梯度強(qiáng)度(25,50,75,100 k J/m2)UVA輻射,檢測(cè)其對(duì)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞活性的影響;檢測(cè)75 k J/m2 UVA輻射對(duì)A375細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO-1、NQO1、GSTP1表達(dá)的影響;檢測(cè)75 k J/m2 UVA輻射對(duì)A375細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)IκBα和COX2蛋白水平的影響。檢測(cè)不同濃度(10,20,30,40,50,100 n M)brusatol對(duì)A375細(xì)胞活性的影響;檢測(cè)50 n M brusatol處理對(duì)A375細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO-1、NQO1、GSTP1表達(dá)的影響;檢測(cè)50 n M brusatol處理對(duì)A375細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路IκBα和COX2蛋白表達(dá)的影響。75 k J/m2 UVA輻射后2 h再用50 n M brusatol處理A375細(xì)胞,檢測(cè)Bcl-2家族Bcl-2、Bcl-xl、Bax蛋白水平變化;75 k J/m2 UVA輻射后2 h再用50 n M brusatol處理A375細(xì)胞,檢測(cè)24 h后細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax、caspase 3、caspase 7、caspase8、caspase 9、cleaved-PARP蛋白水平變化;分別檢測(cè)75 k J/m2 UVA輻射組、50 n M brusatol處理組及75 k J/m2 UVA+50 n M brusatol處理組,人正常角質(zhì)形成細(xì)胞Ha Ca T和惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的凋亡狀況。研究方法:MTS法檢測(cè)A375細(xì)胞的增殖活性;Western blotting電泳檢測(cè)GRP78、ATF4、CHOP、Nrf2等蛋白水平;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Ha Ca T和A375細(xì)胞的凋亡狀況。結(jié)果:①75 k J/m2 UVA輻射后A375細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其靶基因蛋白水平上調(diào),IκBα和COX2蛋白水平有降低趨勢(shì)。75 k J/m2 UVA輻射對(duì)A375細(xì)胞活性損傷小于10%,不會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞的增殖活性;Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平顯著上升,Nrf2總蛋白水平在4-6 h左右達(dá)到最大值,隨后逐漸降低。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2下游抗氧化應(yīng)激蛋白HO-1、NQO1、GSTP1在24 h內(nèi)總體水平逐漸升高;NF-κB的抑制子IκBα蛋白水平有降低趨勢(shì)。COX2蛋白水平也呈降低趨勢(shì),8 h左右蛋白水平最低,而后逐漸升高并顯著高于對(duì)照組。②50 n M brusatol處理誘導(dǎo)A375細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)升高,抑制Nrf2和GSTP1蛋白水平,IκBα水平?jīng)]有顯著性變化。MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50 n M鴉膽子苦醇不會(huì)明顯影響A375細(xì)胞活性。50 n M brusatol處理后A375細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、ATF4、CHOP水平呈時(shí)間依賴性高表達(dá);Nrf2總蛋白水平逐漸降低,4 h左右降到最低值,8 h恢復(fù)后再次降低。Nrf2靶基因GSTP1蛋白水平逐步降低;IκBα蛋白水平?jīng)]有顯著性差異,炎癥因子COX2蛋白水平明顯升高。③75 k J/m2 UVA輻射聯(lián)合50 n M brusatol處理后A375細(xì)胞凋亡率顯著上升至30%,而單獨(dú)75 k J/m2 UVA輻射細(xì)胞凋亡率約10%,50 n M brusatol處理則不會(huì)顯著誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。聯(lián)合處理后Bcl-2家族中抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xl的蛋白水平呈時(shí)間依賴性降低趨勢(shì),促凋亡的Bax蛋白水平呈遞增趨勢(shì)。聯(lián)合處理24 h后A375細(xì)胞內(nèi)Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3與對(duì)照組相比明顯升高,Bcl-2、Bcl-xl、caspase 7等蛋白水平與對(duì)照組相比明顯降低。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示聯(lián)合處理組的凋亡率明顯高于對(duì)照組和兩個(gè)單獨(dú)處理組。結(jié)論:①75 k J/m2 UVA輻射單獨(dú)處理引起A375細(xì)胞小量凋亡;該處理能激活A(yù)375細(xì)胞的氧化應(yīng)激通路。②50 n M brusatol單獨(dú)處理不會(huì)引起A375細(xì)胞凋亡;該處理抑制了Nrf2-ARE信號(hào)通路,誘導(dǎo)A375細(xì)胞COX2的表達(dá)升高并產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。③75 k J/m2 UVA輻射聯(lián)合50 n M brusatol處理激活A(yù)375細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白,細(xì)胞凋亡率顯著升高。
【關(guān)鍵詞】：UVA 鴉膽子苦醇 氧化應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 縮略詞表10-11
• 1 緒論11-22
• 1.1 問題的提出與研究意義11
• 1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀11-20
• 1.2.1 惡性黑色素瘤的研究進(jìn)展11-13
• 1.2.2 腫瘤中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究進(jìn)展13-14
• 1.2.3 Nrf2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用14-17
• 1.2.4 UV及NF-κB信號(hào)通路的研究進(jìn)展17-19
• 1.2.5 細(xì)胞凋亡途徑的簡(jiǎn)介19-20
• 1.3 本文研究目的和研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.3.1 研究目的20
• 1.3.2 主要研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.4 本文創(chuàng)新點(diǎn)21-22
• 2 UVA輻射A375 細(xì)胞產(chǎn)生的相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的研究22-34
• 2.1 引言22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.2.1 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品23-24
• 2.2.3 相關(guān)試劑的配制24-25
• 2.3 相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法25-30
• 2.3.1 A375 細(xì)胞的培養(yǎng)25-26
• 2.3.2 MTS檢測(cè)細(xì)胞活性26
• 2.3.3 Western blot檢測(cè)蛋白水平26-30
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-32
• 2.4.1 UVA輻射對(duì)A375 細(xì)胞活性的影響30
• 2.4.2 75 kJ/m~2 UVA輻射對(duì)A375 細(xì)胞Nrf2 信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路IκBα、COX2 蛋白水平的影響30-32
• 2.5 討論32-34
• 3 鴉膽子苦醇在A375 細(xì)胞中相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的研究34-43
• 3.1 引言34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料34-37
• 3.2.1 主要儀器設(shè)備34-35
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品35-36
• 3.2.3 相關(guān)試劑的配制36-37
• 3.3 相關(guān)試驗(yàn)方法37
• 3.3.1 A375 細(xì)胞的培養(yǎng)37
• 3.3.2 MTS檢測(cè)細(xì)胞活性37
• 3.3.3 Western blot檢測(cè)蛋白水平37
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 3.4.1 鴉膽子苦醇對(duì)A375 細(xì)胞活性的影響37-38
• 3.4.2 50 nM鴉膽子苦醇處理對(duì)A375 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、Nrf2 信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路IκBα、COX2 蛋白水平的影響。38-41
• 3.5 討論41-43
• 4 UVA輻射聯(lián)合鴉膽子苦醇處理誘導(dǎo)A375 細(xì)胞凋亡43-50
• 4.1 引言43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料43-46
• 4.2.1 主要儀器設(shè)備43-44
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品44-46
• 4.2.3 相關(guān)試劑的配制46
• 4.3 相關(guān)試驗(yàn)方法46-47
• 4.3.1 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)46
• 4.3.2 A375 細(xì)胞的培養(yǎng)46
• 4.3.3 Western blot檢測(cè)蛋白水平46
• 4.3.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡46-47
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 4.4.1 75 kJ/m~2 UVA輻射 2h后 50 nM鴉膽子苦醇處理A375 細(xì)胞，激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑47-48
• 4.4.2 聯(lián)合處理誘導(dǎo)A375 細(xì)胞凋亡率顯著升高，HaCaT細(xì)胞凋亡率則沒有明顯變化48-49
• 4.5 討論49-50
• 5 結(jié)論與展望50-51
• 5.1 本研究的主要結(jié)論50
• 5.2 后期研究的展望50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-63

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