本文關鍵詞：DAMPs介導ALA光動力誘導皮膚鱗癌細胞免疫原性死亡的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景皮膚鱗狀細胞癌(Squamous Cell Carcinoma,SCC)是人類常見皮膚腫瘤之一,約占全部非黑素細胞皮膚癌的20%。SCC多見于老年人,好發(fā)于頭面部,外陰及外生殖器。常規(guī)采用手術、激光、冷凍、放療等直接去除或破壞腫瘤組織,但存在組織結構破壞性大、易復發(fā)、復發(fā)后再次治療困難等問題。由于SCC免疫原性弱,宿主免疫功能缺陷或低下無法誘導機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應答,是SCC復發(fā)和轉移的主要原因。因此,尋找理想的抗腫瘤療法--增強腫瘤細胞的免疫原性,殺傷腫瘤細胞的同時,能夠激發(fā)機體抗腫瘤免疫反應,突顯必要。光動力治療(Photodynamic Therapy, PDT)是光敏劑積累于病變組織隨后用相應波長的光源照射,激發(fā)光化學反應導致病變組織破壞的治療方法。5-氨基酮戊酸光動力療法(ALA-PDT)已經(jīng)廣泛的應用于治療皮膚科各種疾病,包括皮膚癌和癌前病變?nèi)缛展庑越腔『头呛谒仄つw病腫瘤(鮑溫病、淺表基底細胞癌)。光動力抗腫瘤機制包括：(1)直接殺死腫瘤細胞(2)破壞腫瘤的脈管系統(tǒng)(3)腫瘤浸潤的免疫細胞的細胞毒作用(4)迅速募集和激活免疫細胞啟動適應性免疫應答。本課題組于1996年在國內(nèi)率先開展ALA-PDT治療淺表性皮膚腫瘤及癌前病變的臨床應用性研究并取得較為滿意的臨床療效,進一步研究還發(fā)現(xiàn)ALA-PDT具有明顯地抑制腫瘤生長的作用并可預防腫瘤的發(fā)生。近年來“免疫原性死亡”這一概念的提出,使得醫(yī)學界對抗原在腫瘤細胞表面表達或釋放以及機體對腫瘤的識別有了新的認識。免疫原性細胞死亡依賴于一種被叫做損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)的分子信號,來激活固有免疫應答進一步誘導特異性抗腫瘤免疫反應。“免疫原性死亡”與正常死亡方式不同,在殺傷腫瘤細胞的同時,激發(fā)機體產(chǎn)生強大的抗腫瘤免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)針對腫瘤局部病灶PDT治療的同時,可以誘導局部或系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應,甚至導致遠處轉移病灶受到抑制同時降低其復發(fā)率。本課題組前期研究結果證實ALA-PDT在治療腫瘤病灶的同時誘導腫瘤細胞ICD,但具體機制尚未明確。本研究旨在探討ALA-PDT是否能夠誘導腫瘤細胞表達DAMPs增強腫瘤細胞免疫原性,誘導腫瘤細胞免疫原性死亡及其分子機制。目的探索ALA-PDT是否能夠誘導皮膚鱗癌細胞表達DAMPs增強皮膚鱗癌細胞免疫原性及其分子機制。包括(1)探索ALA-PDT誘導小鼠皮膚鱗癌細胞高表達DAMPs的最佳時間點及最佳照光劑量。(2)確證DAMPs在ALA-PDT增強皮膚鱗癌細胞免疫原性過程中的關鍵作用。(3)探索DAMPs介導ALA-PDT增強皮膚鱗癌細胞免疫原性的分子機制。方法(1)選擇不同照光劑量及不同時間點檢測ALA-PDT處理的腫瘤細胞DAMPs的表達情況：將小鼠皮膚鱗癌細胞株PECA與0.5mM的ALA孵育5h,以不同劑量(0.25J/cm2、0.5J/cm2、1J/cm2和2J/cm2)處理PECA細胞,收集不同時間點(PDT后1h、3h、6h、9h、12h)的細胞和細胞上清。采用western blot檢測細胞內(nèi)HSP70、 HMGB1和CRT的表達,采用western blot檢測細胞膜上HSP70和CRT的表達,采用Elisa檢測上清中PECA細胞分泌的HSP70和HMGB1。(2)確證DAMPs在ALA-PDT處理的PECA誘導DCs表型及功能過程中的作用：分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細胞(Dendritic cells, DCs), ALA-PDT處理后(0.5mM,5h,0.5J/cm2)的PECA與DCs共孵育,DAMPs抑制組分別加入相應的抑制劑,24h后收集DCs與細胞上清。采用流式細胞術檢測DCs表面分子標志MHCⅡ、CD80和CD86,采用Elisa檢測細胞上清中DCs分泌的IL-12和INF-γ。(3)分析ALA-PDT經(jīng)DAMPs介導,是否通過TLRs-NF-κB途徑增強腫瘤細胞免疫原性：分離培養(yǎng)小鼠骨髓DCs, ALA-PDT處理后(0.5mM,5h,0.5J/cm2)的PECA與DCs共孵育,DAMPs抑制組分別加入相應的抑制劑,24h后收集DCs。采用western blot檢測DCs的TLR2和TLR4及IκB、pIκB和細胞核中NF-κB的表達情況。結果(1)不同照光劑量及不同時間點ALA-PDT處理的腫瘤細胞DAMPs的表達情況：ALA-PDT處理的PECA細胞內(nèi)和細胞膜DAMPs的表達水平上調,至0.5J/cm2PDT后6h達到高峰,ALA-PDT處理的PECA細胞HSP70和HMGB1分泌量上調,至2J/cm2 PDT后6h達到高峰。(2) DAMPs在ALA-PDT處理的PECA誘導DCs表型及功能過程中的作用：PDT-DCs表面分子標志MHCⅡ、CD80和CD86的表達量較未致敏組明顯增加,仍低于LPS刺激組。當HSP70、HMGB1和CRT分別或同時被抑制時PDT-DCs表面分子標志MHCⅡ、CD80和CD86的表達量較前明顯降低。PDT-DCs的IL-12和INF-γ的分泌量較未致敏組明顯增加,當HSP70、 HMGB1和CRT分別或同時被抑制時INF-γ的分泌量較前明顯降低。當HSP70、HMGB1和CRT分別被抑制時IL-12的分泌量較前有下降趨勢,當HSP70、HMGB1和CRT同時被抑制時IL-12的分泌量較前明顯降低。(3) ALA-PDT經(jīng)DAMPs介導,通過TLRs-NF-κB途徑增強腫瘤細胞免疫原性:PDT-DCs表面的TLR2和TLR4的表達明顯上調,當HSP70、HMGB1和CRT分別或同時被抑制時,PDT-DCs表面的TLR2的表達水平降低。當HSP70和HMGB1分別被抑制時,PDT-DCs表面的TLR4的表達水平降低,當CRT被抑制時,TLR4的表達水平未見明顯改變。當HSP70、HMGB1和CRT同時被抑制時,表面的TLR4的表達水平降低。PDT-DCs的I-κB、pI-κB及細胞核內(nèi)的NF-κB表達上調。當HSP70、HMGB1分別被抑制時,PDT-DCs的I-κB、pI-κB及細胞核內(nèi)的NF-κB表達水平降低,但是當CRT被抑制時,PDT-DCs的I-κB、pI-κB及細胞核內(nèi)的NF-κB表達水平未見明顯改變。HSP70、HMGB1和CRT同時被抑制時,PDT-DCs的I-κB、pI-κB及細胞核內(nèi)的NF-κB表達水平明顯降低。結論(1) ALA-PDT可誘導皮膚鱗癌細胞PECA表達DAMPs,細胞膜HSP70和CRT的表達至0.5J/cm2 PDT后6h達到高峰,HSP70和HMGB1分泌量2J/cm2 PDT后6h達到高峰。(2) DAMPs在增強皮膚鱗癌細胞免疫原性,刺激DCs細胞成熟,誘導腫瘤細胞免疫原性死亡過程中發(fā)揮至關重要的作用。(3) DAMPs介導ALA-PDT增強皮膚鱗癌細胞免疫原性的主要分子機制是活化了DCs的TLRs-NF-κB信號通路。
【關鍵詞】：皮膚鱗狀細胞癌 5-氨基酮戊酸光動力療法 損傷相關分子模式 免疫原性細胞死亡 樹突狀細胞
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 縮略詞表13-14
• 前言14-19
• 參考文獻17-19
• 第一部分 ALA-PDT對皮膚鱗癌細胞表達DAMPs的影響19-32
• 1 引言19
• 2 實驗材料19-20
• 3 實驗方法20-24
• 4 結果24-28
• 5. 討論28-30
• 6 結論30
• 7 參考文獻30-32
• 第二部分 DAMPs介導ALA-PDT增強皮膚鱗癌免疫原性32-43
• 1 引言32
• 2 材料與方法32-33
• 3 實驗方法33-35
• 4 結果35-39
• 5 討論39-41
• 6 結論41
• 7 參考文獻41-43
• 第三部分 DAMPs通過TLRs-NF-κB途徑介導ALA-PDT增強皮膚鱗癌免疫原性43-53
• 1 引言43
• 2材料與方法43-44
• 3方法44-47
• 4 結果47-49
• 5 討論49-51
• 6 結論51
• 7 參考文獻51-53
• 附錄53-54
• 本人簡歷53
• 學習和工作經(jīng)歷53
• 在學期間的研究成果目錄53-54
• 致謝54-56
• 課題綜述56-63
• 參考文獻61-63

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本文編號：365148