皮膚致敏性測試是化妝品原料和產(chǎn)品安全性評價(jià)的重要內(nèi)容。隨著國際社會對實(shí)驗(yàn)動物福利倫理和3R原則日益重視和不斷推行,以及歐盟等國家相繼對化妝品成分和產(chǎn)品禁止動物試驗(yàn)后,化妝品安全性評價(jià)體外替代方法研究成為國際發(fā)展趨勢和研究熱點(diǎn)。基于皮膚致敏有害結(jié)局通路的關(guān)鍵事件,開發(fā)模擬體內(nèi)致敏過程的模型,是目前國內(nèi)外體外替代方法研發(fā)的基本策略。在致敏物角質(zhì)細(xì)胞激活水平,基于Keap1-Nrf2抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant Response Element,ARE）熒光素酶報(bào)告模型(KeratinoSens^TM和LuSens)均能在體外反映化合物皮膚致敏特性。但以上細(xì)胞模型均為隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因熒光素酶報(bào)告細(xì)胞模型,實(shí)為間接評估皮膚致敏基因的表達(dá),大量基因拷貝的轉(zhuǎn)入也影響致敏評估結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著CRISPR/Cas9介導(dǎo)精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)的發(fā)展,可將熒光素酶報(bào)告基因定點(diǎn)整合到內(nèi)源靶基因表達(dá)框內(nèi),達(dá)到真正實(shí)時同步報(bào)告內(nèi)源靶基因的表達(dá),從而更加準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞致敏的表型。本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9和同源重組介導(dǎo)的精準(zhǔn)基因編輯技術(shù),成功建立了熒光素酶基因敲入的HMOX1實(shí)時報(bào)... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：148 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

直接多肽反應(yīng)測試方法

第一章 緒論硫醇類蛋白質(zhì)加合物進(jìn)行熒光檢測，可大幅縮短檢測時間（圖 1-5）。Avonto 等通過測試 28 種皮膚致敏物和 8 種非致敏物來評估 HTS-DCYA 的預(yù)測性能，該方法的準(zhǔn)確度靈敏度和特異性分別為 82％，79％和 90％。在同一測試數(shù)據(jù)集下 DPRA 的準(zhǔn)確性，敏感性和特異性分別為 92％，100％和 80％[32]。此外，Avonto 等還嘗試應(yīng)用 HTS-DCYA方法對植物 取物進(jìn)行致敏性檢測，展現(xiàn)出了一定的復(fù)雜組分致敏性預(yù)測能力[41,42]。

U6-sgRNA 重組表達(dá)載體構(gòu)建1）根據(jù) HMOX1 的基因組序列，本研究選擇其第 5 外顯子的終止密碼子進(jìn)行 sgRNA 設(shè)計(jì)（http://crispr.mit.edu/），最終優(yōu)選了 3 個特異性較強(qiáng)的點(diǎn)，sgRNA 設(shè)計(jì)結(jié)果如圖 2-6 所示：圖 2-6 sgRNA 設(shè)計(jì)示意圖Figure 2-6 Schematic of sgRNA design2）以 HaCaT 細(xì)胞進(jìn)行基因組為模板對 sgRNA 打靶位點(diǎn)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 Sanger 測序，通過序列比對，結(jié)果如圖 2-6 所示，待打靶序列與 NCBI 1 基因參考序列一致。sgRNA1


本文編號：3241774