本文關鍵詞：PCR快速鑒定皮膚癬菌病，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的 目前實驗室常用的皮膚癬菌病的診斷方法為鏡檢和培養(yǎng)，該方法對操作人員的專業(yè)性要求較高，而且培養(yǎng)耗時較長，在皮膚癬菌病的快速鑒定方面，雖然國內(nèi)已有相關的分子研究報導，但都難以應用于臨床。本研究通過對皮膚癬菌菌株以及臨床診斷為皮膚癬菌病患者的皮屑標本進行研究，將PCR方法與傳統(tǒng)診斷方法的診斷結(jié)果進行統(tǒng)計學對比，探索臨床皮膚癬菌病的快速簡便特異的新型診斷方法。 研究方法 第一部分使用65株皮膚癬菌臨床株以及50株非皮膚癬菌臨床株和2例人DNA用于PCR體系的優(yōu)化及CHS1(Chitin synthase1)引物的評估。采用1步法處理皮膚癬菌及非皮膚癬菌菌株獲得菌株DNA，然后用皮膚癬菌特異性引物CHS1(panDerm1:5’G A A G A A G A T T G T C G T T T G C A T C G T C T C3’,panDerm2:5’C T C GAG G T C AAAAG C AC G C C AGAG3’）對獲得的DNA產(chǎn)物進行PCR擴增。皮膚癬菌通用引物的敏感性測定：將獲得的菌株DNA以及人DNA進行PCR擴增后跑電泳，觀察是否出現(xiàn)特定大小的陽性條帶。 PCR反應體系的敏感性測定：用超微量分光光度計測量皮膚癬菌菌液的DNA濃度，再將皮膚癬菌菌液的DNA進行10倍連續(xù)稀釋，獲得不同濃度的皮膚癬菌菌液，隨后進行PCR擴增，記錄特定大小的陽性條帶出現(xiàn)時的最小的皮膚癬菌DNA濃度值，PCR重復3次。 第二部分，將臨床收集的119例皮屑標本，均勻分成三份，分別進行鏡檢、培養(yǎng)和PCR鑒定。采用Brillowska-Dabrowsk的2步提取法從臨床標本中快速提取皮膚癬菌DNA,對臨床標本的DNA產(chǎn)物進行PCR擴增時，為了防止體系中PCR抑制物造成的假陰性結(jié)果，設計了IC(Internal control內(nèi)部對照)，內(nèi)部對照為大腸桿菌質(zhì)粒，該質(zhì)�？膳c皮膚癬菌CHS1特異性引物反應，產(chǎn)生510bp的內(nèi)部對照條帶。我們設計并合成了特異性引物，其序列為For:5-G AAGAAGAT T G T C G T T T G C AT C GT C T C AG G G T T T GAT T C T G G C T C AG-3，Rev:5-C T C GAG G T C AAAA G C A C G C C AG A G G TAT TA C C G C G G C G G C T G G-3，該引物能與大腸桿菌DNA反應，，生成510bp片段，該片段被插入大腸桿菌質(zhì)粒，合成本實驗所需的質(zhì)粒。根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否為皮膚癬菌感染，若電泳結(jié)果出現(xiàn)366bp的條帶，則為皮膚癬菌感染，若未出現(xiàn)此特異性條帶且出現(xiàn)了510bp的內(nèi)部對照條帶，則能判斷為非皮膚癬菌感染，若未出現(xiàn)此特異性條帶且未出現(xiàn)510bp的內(nèi)部對照條帶，則為假陰性結(jié)果。最后將臨床標本的PCR結(jié)果與傳統(tǒng)診斷方法進行一致性比較。 結(jié)果 第一部分：所有皮膚癬菌菌株經(jīng)PCR擴增后均出現(xiàn)366bp的陽性條帶，非皮膚癬菌菌株及人DNA經(jīng)PCR擴增后均未出現(xiàn)任何條帶。將濃度為600ng/ul的皮膚癬菌DNA濃度經(jīng)10倍連續(xù)稀釋后，得到7個濃度的菌液：600ng~6pg經(jīng)PCR擴增后出現(xiàn)366bp的陽性條帶，第8個600fg濃度經(jīng)PCR擴增后未出現(xiàn)任何條帶。 第二部分：在119例臨床標本中，PCR與傳統(tǒng)診斷方法的一致性檢驗Kappa值為0.910，P0.01，兩種方法在診斷結(jié)果方面具有較高的一致性。然而PCR方法在5小時內(nèi)即可完成從標本處理至結(jié)果判讀的全過程，且操作簡便，判斷結(jié)果客觀。 結(jié)論 皮膚癬菌通用引物CHS1具有較高的特異性，可用作檢測皮膚癬菌的特異性引物，本實驗PCR體系的敏感度較高，為6pg。PCR在臨床標本的皮膚癬菌檢測方面更加簡便快速，可替代現(xiàn)有皮膚癬菌病的傳統(tǒng)診斷方法。
【關鍵詞】：PCR 癬菌病 CHS1 傳統(tǒng)診斷
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R756
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文縮寫表10-11
• 前言11-17
• 參考文獻14-17
• 第一部分 PCR 體系敏感性及特異性測定17-25
• 實驗材料18-19
• 實驗菌株及人 DNA18
• 實驗所用引物18-19
• 實驗所用試劑19
• 實驗所用器械19
• 實驗方法19-21
• 菌種的復活19-20
• 沙保氏培養(yǎng)基的配置20-21
• 菌株 DNA 的提取21
• PCR 反應21
• 不同 DNA 濃度梯度的稀釋液21
• 通用引物特異性測定21
• 實驗結(jié)果21-23
• 用引物的特異性結(jié)果21-22
• PCR 體系的反應敏感性測試22-23
• 討論23-25
• 第二部分 皮膚癬菌病傳統(tǒng)診斷方法與 PCR 方法的對比25-40
• 實驗材料26-27
• 臨床皮屑標本26
• 實驗所用試劑26
• 實驗所用引物26-27
• 實驗所用器械27
• 實驗方法27-29
• 皮屑的收集27
• 皮屑的分配27
• 皮屑的 DNA 提取27-28
• 內(nèi)部對照(Internal control IC)的構(gòu)建28-29
• 實驗結(jié)果29-35
• 皮屑標本的傳統(tǒng)診斷方法與 PCR 診斷方法的結(jié)果對比29-32
• 傳統(tǒng)方法與 PCR 診斷法檢出率的對比32
• 皮屑標本的 PCR 檢測結(jié)果32-33
• 臨床標本電泳圖33-34
• 統(tǒng)計學分析34-35
• 討論35-40
• 全文小結(jié)40-42
• 參考文獻42-45
• 綜述45-58
• 參考文獻54-58
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況58-59
• 致謝59-60

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 高媛;陳烽烽;鄧孝廷;田淑琴;丁莉;;致病真菌PCR檢測方法的建立[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年04期

2 徐建平;Heather Yoell;;甲真菌病概述及其診斷最新進展(英文)[J];實驗與檢驗醫(yī)學;2012年02期

3 談燕;陳歡;趙瑾;陳江漢;;一步法快速鑒定皮膚癬菌[J];臨床軍醫(yī)雜志;2014年08期

4 楊靜;童中勝;萬U

本文編號：323099