本文關(guān)鍵詞：重組IL-24與IL-24-CN的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其治療惡性黑色素瘤的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重、老齡化的加重及人們不良生活習(xí)慣的增多,癌癥發(fā)病人數(shù)及因癌癥死亡人數(shù)呈逐年遞增的趨勢。癌癥轉(zhuǎn)移是造成各種腫瘤疾病致死的主要原因,約有90%的癌癥病人死于癌轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的癌癥治療手段一般對人體存在較大的毒副作用,且并不總是有效。因此急需開發(fā)高效能低成本的抗腫瘤藥物。白細(xì)胞介素(IL)-24是一種新型細(xì)胞因子,屬于IL-10家族成員,體內(nèi)外活性研究均顯示其具有選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能,對正常細(xì)胞沒有毒性作用。IL-24的這一特點(diǎn)使其在治療腫瘤疾病方面有較大的應(yīng)用潛力,成為近年來研究的熱點(diǎn)。Contortrostatin (CN)是從銅頭蝮蛇毒素中提取的一種同源二聚體解離素多肽,通過其C-端柔性環(huán)區(qū)域的RGD序列與腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的高親和力相互作用,能夠顯著地抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤血管的生成,是唯一最具潛力用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的蛇毒素提取物。本文對IL-24和IL-24-CN融合蛋白在大腸桿菌中的重組表達(dá)及生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。 為了實(shí)現(xiàn)IL-24在大腸桿菌中的非融合表達(dá),我們優(yōu)化了IL-24mRNA翻譯起始區(qū)(TIR)的二級結(jié)構(gòu),使mRNA TIR序列自由能由-22.0kcal/mol降低為-9.07kcal/mol,降低了約2.4倍,促進(jìn)了較為疏松的二級結(jié)構(gòu)的形成。通過PCR、酶切和連接,我們成功將IL-24突變基因克隆至pET-32a(+)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示與非優(yōu)化(幾乎沒有表達(dá))相比IL-24的表達(dá)水平顯著提高,達(dá)菌體總蛋白的26%。我們通過兩步包涵體洗滌、變復(fù)性和離子交換色譜純化獲得了純度約為93%的nrIL-24。 為了增強(qiáng)IL-24的抗腫瘤活性,我們構(gòu)建了IL-24-CN融合表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IL24-CN,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta-gami B(DE3)pLysS,誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示融合蛋白以可溶形式表達(dá),可溶表達(dá)量達(dá)破碎上清的39.3%。我們建立了融合蛋白的分離純化及標(biāo)簽切除工藝,獲得了較高純度的IL-24-CN。 本文分別采用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Trans well實(shí)驗(yàn)對重組蛋白的活性進(jìn)行了驗(yàn)證,并初步分析了IL-24-CN抗腫瘤活性機(jī)制。 (1)MTT結(jié)果顯示nrIL-24和IL-24-CN可呈濃度依賴型抑制惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的生長,IL-24-CN表現(xiàn)出更高的抑制活性。為了進(jìn)一步確定這種生長抑制作用與誘導(dǎo)凋亡作用的關(guān)系,我們進(jìn)行了annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn),與對照組相比nrIL-24和IL-24-CN均能顯著誘導(dǎo)A375細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)凋亡率分別為16.8%和26.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明nrIL-24和IL-24-CN可通過誘導(dǎo)A375細(xì)胞的凋亡抑制其生長,且IL-24-CN對A375細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制活性。 (2)我們首先采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)分析了重組蛋白對A375細(xì)胞遷移的影響,結(jié)果表明,24h后以PBS處理的對照組劃痕明顯變小,與實(shí)驗(yàn)組相比A375細(xì)胞有明顯的遷移,遷移率為33.07%。以nrIL-24處理的A375細(xì)胞劃痕距離也有減小,遷移率為26.59%。以IL-24-CN處理的腫瘤細(xì)胞遷移距離最小,遷移率為16.82%,說明IL-24-CN對腫瘤細(xì)胞的遷移有顯著的抑制作用且活性強(qiáng)于nrIL-24,遷移抑制率為49.14%。 (3) Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了上述結(jié)果,nrIL-24對A375的遷移和侵襲都有一定的抑制作用,相對抑制率分別為24.68%和13.56%。IL-24-CN對A375細(xì)胞的遷移和侵襲有明顯的抑制作用,相對抑制率分別為51.95%和45.76%。 (4)通過檢測腫瘤細(xì)胞與已包被nrIL-24和IL-24-CN的平板的結(jié)合能力,反映重組蛋白對腫瘤細(xì)胞的親和力,同時(shí)設(shè)置只包被BSA的孔板為對照。只包被BSA的孔板幾乎沒有A375細(xì)胞的粘附,包被重組蛋白nrIL-24的孔板有少許A375細(xì)胞被粘附于板底,包被IL-24-CN的孔底對A375細(xì)胞的粘附數(shù)量顯著增多,這也說明CN對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的親和力,通過與CN的融合表達(dá)可提高IL-24到腫瘤細(xì)胞表面的靶向性。 綜上所述,本研究通過非融合表達(dá)策略實(shí)現(xiàn)了重組IL-24的高效制備,純化獲得的nrIL-24可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長,且對腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有一定抑制作用。本研究還構(gòu)建了IL-24-CN的可溶表達(dá)系統(tǒng),初步建立了重組蛋白的純化工藝,IL-24-CN具有比nrIL-24更強(qiáng)的腫瘤生長抑制活性,且可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,說明CN與IL-24的融合表達(dá)策略對提高其抗腫瘤活性有協(xié)同作用。本研究的工作為IL-24其進(jìn)一步的活性研究及應(yīng)用于癌癥治療奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：白細(xì)胞介素-24 Contortrosatin 重組表達(dá) 純化 抗腫瘤
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 前言12-30
• 1.1 癌癥研究現(xiàn)狀及治療策略12-18
• 1.1.1 癌癥的特點(diǎn)12-13
• 1.1.2 腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制13-15
• 1.1.3 幾種重要的腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控因子15-16
• 1.1.4 癌癥的治療策略16-17
• 1.1.5 癌癥治療的啟示17-18
• 1.2 MDA-7/IL-24研究進(jìn)展18-24
• 1.2.1 MDA-7/IL-24概述18
• 1.2.2 MDA-7/IL-24的表達(dá)特性18-20
• 1.2.3 IL-24的受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)20
• 1.2.4 IL-24的功能20-23
• 1.2.5 IL-24腫瘤治療應(yīng)用進(jìn)展23-24
• 1.3 解離素研究進(jìn)展24-27
• 1.3.1 解離素的分類24
• 1.3.2 解離素的結(jié)構(gòu)24-25
• 1.3.3 解離素的功能25-27
• 1.4 CN研究進(jìn)展27-29
• 1.4.1 CN的抗腫瘤活性27-28
• 1.4.2 CN抗腫瘤應(yīng)用研究現(xiàn)狀28-29
• 1.5 本課題的研究目的、內(nèi)容及意義29-30
• 1.5.1 研究目的和意義29
• 1.5.2 研究內(nèi)容29-30
• 第2章 重組IL-24的構(gòu)建30-45
• 2.1 引言30
• 2.2 材料和方法30-39
• 2.2.1 載體和宿主菌30-31
• 2.2.2 主要儀器31
• 2.2.3 主要試劑31-32
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)常用試劑的配制32-33
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)方法33-39
• 2.3 結(jié)果39-44
• 2.3.1 密碼子優(yōu)化降低mRNA TIR二級結(jié)構(gòu)自由能39-40
• 2.3.2 PCR擴(kuò)增目的基因40
• 2.3.3 單克隆的篩選40-41
• 2.3.4 重組質(zhì)粒測序41
• 2.3.5 nrIL-24的誘導(dǎo)表達(dá)41-42
• 2.3.6 包涵體的變性和復(fù)性42-43
• 2.3.7 nrIL-24的純化43
• 2.3.8 重組蛋白濃度測定43-44
• 2.4 討論44-45
• 第3章 重組IL-24-CN的構(gòu)建45-56
• 3.1 引言45
• 3.2 材料和方法45-49
• 3.2.1 載體和宿主菌45
• 3.2.2 主要儀器45
• 3.2.3 主要試劑45
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)常用試劑的配制45
• 3.2.5 實(shí)驗(yàn)方法45-49
• 3.3 結(jié)果49-54
• 3.3.1 PCR擴(kuò)增獲得IL-24-CN編碼基因49-50
• 3.3.2 單克隆的篩選50
• 3.3.3 pET32a-IL24-CN的序列測定50-51
• 3.3.4 pET32a-IL24-CN的誘導(dǎo)表達(dá)51
• 3.3.5 融合蛋白的純化51-52
• 3.3.6 融合蛋白標(biāo)簽的切除52-54
• 3.4 討論54-56
• 第4章 活性檢測56-67
• 4.1 引言56
• 4.2 材料和方法56-60
• 4.2.1 材料56
• 4.2.2. 主要儀器56-57
• 4.2.3 主要試劑57
• 4.2.4 實(shí)驗(yàn)方法57-60
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-65
• 4.3.1 MTT法檢測重組蛋白對A375細(xì)胞增殖能力的影響60-61
• 4.3.2 重組蛋白對A375細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡活性61
• 4.3.3 重組蛋白對A375細(xì)胞遷移和侵襲的影響61-64
• 4.3.4 IL-24-CN對A375細(xì)胞粘附作用64-65
• 4.4 討論65-67
• 第5章 結(jié)論與展望67-68
• 5.1 結(jié)論67
• 5.2 展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 致謝75-76
• 科研成果76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 董兵;朱毅敏;;癌癥分子靶向治療的研究現(xiàn)狀[J];癌癥;2010年03期

2 徐永強(qiáng);蛇毒抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究現(xiàn)狀[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2002年05期

3 張曄;芮景;;蛇毒解離素抗腫瘤研究進(jìn)展[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2007年09期

4 吳菲;林國楨;張晉昕;;我國惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢[J];中國腫瘤;2012年02期

  本文關(guān)鍵詞：重組IL-24與IL-24-CN的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其治療惡性黑色素瘤的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：316523