發(fā)布時間：2020-11-11 04:10

　　 背景:原發(fā)性皮膚淀粉樣變(Primary cutaneous amyloidosis,PCA)是一種頑固性瘙癢性皮膚病,其典型的組織病理學改變?yōu)楸砥ぜ毎麑釉龊窈徒腔^度,真皮乳頭層可見大量淀粉樣物質沉積。淀粉樣物質的形成與角質形成細胞凋亡密切相關。大多數(shù)原發(fā)性皮膚淀粉樣變病例為散發(fā),但是南美洲和臺灣曾多次報道過家族聚集現(xiàn)象,即家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變(Familiar primary cutaneous amyloidosis,PCA)。家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變的致病基因被定位于OSMR基因。OSMR基因編碼OSMRβ蛋白,后者為OSM二型受體及IL31受體的組成成分,這兩種受體分別與兩種細胞因子OSM和IL31結合,通過JAK-STAT和MAPK通路完成磷酸化和信號傳導。當OSMR基因發(fā)生突變時,一方面突變的角質形成細胞更易發(fā)生凋亡,導致角蛋白在真皮淺層沉積;另一方面,OSMRβ/IL31RA信號通路障礙,對抗凋亡的作用減弱,角質形成細胞凋亡增加,退化的角化性物質在真皮淺層沉積,最終導致皮膚淀粉樣變的發(fā)生。沙利度胺對多種頑固性瘙癢性皮膚病有效,可能是通過不同的作用機制。原發(fā)性皮膚淀粉樣變治療抵抗,傳統(tǒng)治療方法如抗組胺藥、糖皮質激素及窄波紫外線效果有限。曾有報道應用沙利度胺治療輕鏈淀粉樣變。我們前期應用沙利度胺成功治療了家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變患者,臨床應用發(fā)現(xiàn)沙利度胺可明顯緩解皮膚瘙癢,并在治療后的組織切片中發(fā)現(xiàn)淀粉樣物質明顯減少。在前期實驗中,我們將OSMR基因敲除細胞系進行全蛋白組學鑒定,得出多種差異蛋白表達,差異蛋白的功能、KEGG富集結果。其中,以TC-PTP上調表達最為顯著。同時,KEGG通路富集結果顯示,上調蛋白在Jak-STAT通路富集現(xiàn)象最為顯著。T細胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC-PTP;由PTPN_2編碼),是PTP家族中第一個被認知的成員,特異性表達于胚胎和成人組織細胞中,尤其在造血系統(tǒng)存在高表達。TC-PTP參與包括細胞周期調控和細胞凋亡等通過去磷酸化來完成各種生物學功能的調節(jié),參與調節(jié)的目標底物包括JAK1、JAK3、Stat1、Stat3、Stat5等,TC-PTP對JAK/Stat通路起到負向調節(jié)的作用。學者通過構建PTPN_2基因敲除鼠,提取小鼠皮膚組織上皮細胞,應用Western Blot方法檢測P-AKT和P-Stat3的水平,結果顯示二者表達均升高。紫外線照射能夠增加Stat3磷酸化水平,同時能夠使TC-PTP表達增加。學者通過構建PTPN_2基因敲除及過表達細胞系,給予不同時間紫外線照射干預,得出結論,在紫外線照射下,TC-PTP能夠抑制Stat3介導的小鼠角質形成細胞的增殖功能,因此,TC-PTP在調節(jié)細胞增殖和凋亡中具有重要的作用。OSMR基因是否能夠通過上調TC-PTP的表達,對家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變的發(fā)生機制產(chǎn)生影響。沙利度胺是否通過作用于Stat3通路對皮膚淀粉樣變的發(fā)生產(chǎn)生影響,為本實驗關注的重點。實驗材料和方法:1、實驗對象細胞系選擇為人角質形成細胞系(HaCaT),購于江蘇凱基生物技術股份有限公司。2、siRNA轉染方法敲除目標基因OSMR,PTPN_2將細胞接種于6孔板,每孔50萬個細胞。Lipofectamine?RNAiMAX被用作轉染試劑。Silencer?Select negative control siRNA 1被用作陰性對照。轉染后于24、48、72小時提取RNA和蛋白用于驗證敲除效率。使用10 nmol siRNA為最終濃度。3、Icelligence方法篩選沙利度胺作用濃度將細胞接種于Icelligence細胞培養(yǎng)板,分別加入沙利度胺濃度為0,10nM,100nM,1000nM,10000nM,通過細胞增殖曲線,確定藥物對細胞增殖無影響的最適濃度。4、MTS檢測加入沙利度胺前后siOSMR對細胞增殖的影響利用MTS方法檢測加入沙利度胺前后OSMR基因敲除對細胞增殖的作用。將siOSMR細胞組,加入沙利度胺后siOSMR細胞組和陰性對照組細胞接種于96孔板中,分別于第0天、1天、2天、3天和4天進行檢測,490nm處觀察吸光度值。5、流式細胞術檢測加入沙利度胺前后siOSMR對細胞凋亡的影響利用流式細胞術檢測加入沙利度胺前后siOSMR對細胞凋亡的影響。將siOSMR細胞組,加入沙利度胺后si OSMR細胞組和陰性對照組細胞接種于六孔板中,用FITC AnnexinⅤ凋亡試劑盒和PI試劑檢測細胞凋亡的變化。6、利用慢病毒轉染技術建立OSMR基因敲除穩(wěn)轉細胞系細胞接種于24孔板,將Hacat細胞MOI值定為100,確定慢病毒轉染量。于轉染后24、48、72小時于熒光顯微鏡觀察轉染效率。加入puromycin對轉染細胞進行篩選。應用實時定量PCR檢測,western blot檢測的方法對建立的可穩(wěn)定傳代細胞進行驗證。7、對OSMR基因敲除穩(wěn)轉細胞系進行人細胞樣本全蛋白定量蛋白質組學鑒定將細胞分為慢病毒對照組和OSMR基因敲除組,進行人細胞樣本全蛋白定量蛋白質組學鑒定,包括差異蛋白表達檢測和差異蛋白功能分類、功能富集和聚類分析。8、Western blot方法檢測沙利度胺對Stat1、3、5,Akt通路蛋白表達的影響采用Western blot方法檢測加入沙利度胺前后Stat1、3、5,Akt通路蛋白表達水平的變化。按照蛋白提取法提取細胞中蛋白;BCA檢測蛋白濃度;經(jīng)制膠、跑膠、轉膜、封閉、一抗、二抗、ECL顯色并拍照,觀察蛋白表達變化。9、統(tǒng)計學分析利用GraphPad Prism 5軟件對資料進行統(tǒng)計學分析及圖表的繪制,組間比較用t檢驗及方差分析,p0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。結果:1、OSMR基因敲除對角質形成細胞增殖功能的影響應用MTS方法,檢測OSMR基因敲除對角質形成細胞增殖功能的影響。結果顯示,OSMR基因敲除可以顯著抑制細胞的增殖能力,差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.001)2、OSMR基因敲除對角質形成細胞凋亡的影響采用流式細胞術的方法,檢測OSMR基因敲除對角質形成細胞凋亡的影響。結果顯示,OSMR基因敲除可以使角質形成細胞凋亡增加,重復三次實驗,結果差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.05)3、沙利度胺對OSMR基因敲除角質形成細胞增殖功能的影響應用MTS方法,檢測沙利度胺對OSMR基因敲除角質形成細胞增殖功能的影響。結果發(fā)現(xiàn),沙利度胺可以增加OSMR基因敲除角質形成細胞的增殖能力,差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.05)4、沙利度胺對OSMR基因敲除角質形成細胞凋亡的影響采用流式細胞術的方法,檢測沙利度胺對OSMR基因敲除角質形成細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn),沙利度胺降低OSMR基因敲除角質形成細胞的凋亡,重復三次實驗,差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.05)5、沙利度胺對OSMR相關通路蛋白表達的影響應用Western Blot方法,檢測沙利度胺對OSMR相關通路蛋白表達的影響。結果顯示,OSMR基因敲除角質形成細胞P-Stat3表達量減少,加入沙利度胺后,P-Stat3表達量增加。OSMR基因敲除對Stat3的表達無明顯影響。OSMR基因敲除角質形成細胞Stat1和P-Stat1表達量均減少,以P-Stat1減少更為明顯。加入沙利度胺后,Stat1和P-Stat1表達量無明顯增加。OSMR基因敲除對角質形成細胞Stat5和P-Stat5表達量無明顯影響。OSMR基因敲除對角質形成細胞Akt和P-Akt表達量無明顯影響。6、人細胞樣本全蛋白定量蛋白質組學鑒定結果將OSMR基因敲除穩(wěn)轉細胞系與慢病毒轉染對照組進行人細胞樣本全蛋白定量蛋白質組學鑒定,結果顯示,OSMR基因敲除可以導致多種差異蛋白表達,其中以上調TC-PCP表達最為顯著。KEGG通路富集結果顯示,上調蛋白在Jak-STAT通路富集現(xiàn)象最為顯著。7、PTPN_2基因敲除對角質形成細胞增殖功能的影響應用MTS方法,檢測PTPN_2基因敲除對角質形成細胞增殖功能的影響。結果顯示,PTPN_2基因敲除可以顯著促進細胞的增殖,差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.05)8、沙利度胺對PTPN_2過表達角質形成細胞增殖功能的影響應用MTS方法,檢測沙利度胺對PTPN_2過表達角質形成細胞增殖功能的影響。結果顯示,沙利度胺可以增加PTPN_2過表達角質形成細胞的增殖能力,差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.05)9、PTPN_2對OSMR相關通路蛋白表達的影響(1)沙利度胺對PTPN_2基因敲除角質形成細胞Stat3和P-Stat3表達的影響。PTPN_2敲除角質形成細胞P-Stat3表達量明顯增多,加入沙利度胺后,P-Stat3表達量減少。這與OSMR基因敲除對P-Stat3作用的影響正好相反,提示OSMR基因與PTPN_2可能位于同一條信號通路上,且OSMR基因位于PTPN_2上游,OSMR基因抑制PTPN_2的作用。PTPN_2基因敲除對Stat3的表達無明顯影響。(2)PTPN_2基因敲除對角質形成細胞P-Stat5和Stat5表達量無影響,對Akt和P-Akt表達量無影響。(3)沙利度胺對PTPN_2基因過表達角質形成細胞Stat3和P-Stat3表達的影響。PTPN_2過表達角質形成細胞P-Stat3表達量減少,加入沙利度胺后,P-Stat3表達量增加。這與OSMR基因敲除對P-Stat3作用同向,再次驗證了OSMR基因與PTPN_2可能位于同一條信號通路上,且OSMR基因位于PTPN_2上游,OSMR基因抑制PTPN_2的作用。PTPN_2基因過表達對Stat3的表達無明顯影響。(4)PTPN_2過表達對角質形成細胞P-Stat5和Stat5表達量無影響,對Akt和P-Akt表達無影響。10、Stat3通路抑制劑對PTPN_2和OSMR基因敲除細胞增殖功能的影響加入STA-21后,PTPN_2基因敲除和OSMR基因敲除角質形成細胞的增殖功能都受到顯著抑制。由此可見,PTPN_2基因和OSMR基因對細胞增殖的影響通過Stat3通路起作用。STA-21可以顯著抑制,加入沙利度胺作用后的兩組基因敲除細胞角質形成細胞的增殖能力。由此可見,沙利度胺可能通過Stat3通路,對PTPN_2基因敲除和OSMR基因敲除角質形成細胞增殖功能產(chǎn)生影響。結論:1、OSMR基因敲除降低角質形成細胞的增殖能力,增加凋亡水平。2、沙利度胺增加OSMR基因敲除角質形成細胞的增殖能力,降低凋亡水平,增加P-Stat3的表達水平。3、OSMR基因敲除上調角質形成細胞TC-PTP表達,作用于Stat3通路。4、沙利度胺可能作用于Stat3通路,通過對TC-PTP或其上游分子發(fā)生作用,對OSMR相關通路蛋白表達以及細胞的生物學功能產(chǎn)生影響。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R758.3
【部分圖文】：

1 前言粉樣變（Primary cutaneous amyloidosis，PCA）型的組織病理學改變?yōu)楸砥ぜ毎麑釉龊窈徒腔镔|沉積[1]。淀粉樣物質的形成與角質形成細胞淀粉樣變病例為散發(fā)，但是南美洲和臺灣曾多次發(fā)性皮膚淀粉樣變（Familial PCA，F(xiàn)PCA）[3]�；A是通過基因連鎖分析和候選基因分析方法對臺灣的FPCA家系進行了基因組掃描，發(fā)現(xiàn)了在連鎖[3]。隨后，通過對五號染色體存在連鎖的基因定位于OSMR基因（oncostatin M receptor (OR基因突變位點如下圖所示（圖1.1），其中P694

2圖1.2 OSMR基因突變導致信號通路傳導障礙OSM可以誘導角質形成細胞遷移，引起表皮增生[7]。IL31是近年來發(fā)現(xiàn)的，與皮膚瘙癢密切相關[13]。在小鼠淋巴細胞中高表達IL31可以引起搔抓和

家族病例 3 10 8 3 2 2 2 2 2 1均值 8.08 6.58 5.17 4.50 4.17 2.60 2.60 2.00 1.60標準差 0.88 1.04 1.25 1.23 1.28 0.40 0.40 0.55 0.68沙利度胺劑量100mg/d 75mg/d 50mg/d注：應用視覺模擬評分方法(VAS)評價瘙癢強度，0 分-10 分3.2 驗證 siRNA 轉染方法敲除 OSMR 基因效率1、分別于小干擾RNA轉染24、48、72小時提取細胞RNA，進行基因敲除驗證。結果如下圖，圖中可見在RNA水平OSMR基因的敲除效率良好。圖3.1為O基因擴增曲線，圖3.2為RNA水平OSMR基因敲除效率。（* p<0.05，** p<0.01p<0.001，**** p<0.001，T檢驗）
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