背景麻風(fēng)病是由麻風(fēng)分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病。麻風(fēng)分枝桿菌主要侵犯皮膚和神經(jīng),造成肢體的畸形和殘廢。目前,麻風(fēng)診斷常見的方法包括皮膚組織液細(xì)菌學(xué)檢查,組織病理,血清抗體檢測(cè)等,但是仍有一些臨床表現(xiàn)不典型、少菌型、純神經(jīng)炎型麻風(fēng)病患者會(huì)出現(xiàn)漏診和誤診。而延誤診斷可能會(huì)造成不可逆性神經(jīng)損傷,面容毀損等。因此,麻風(fēng)病的早期精準(zhǔn)診斷非常重要。經(jīng)典麻風(fēng)感染分為五大類,呈光譜樣分布,對(duì)不同型別麻風(fēng)患者差異表達(dá)的相關(guān)分子,代謝產(chǎn)物,蛋白等研究有利于發(fā)掘更有價(jià)值的診斷標(biāo)志物,同時(shí)也有利于對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探索研究。目的:挖掘不同型別麻風(fēng)病患者血清外泌體特異性分子改變,同時(shí)探索相關(guān)機(jī)制。方法:1.對(duì)不同型別麻風(fēng)病患者和正常對(duì)照血清外泌體進(jìn)行miRNA微陣列檢測(cè)分析,獲得差異顯著的miRNA,擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證,確定差異表達(dá)顯著的miRNA,單獨(dú)評(píng)估或使用logistic二元回歸模型綜合變量,繪制ROC曲線評(píng)估其診斷價(jià)值。2.在體外細(xì)胞水平建立人單核/巨噬細(xì)胞和麻風(fēng)菌共培養(yǎng)體系,驗(yàn)證差異表達(dá)顯著的miRNA在培養(yǎng)上清外泌體和細(xì)胞層面的表達(dá)水平。3.通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的調(diào)控。4.利用非靶向代謝組學(xué)的方法對(duì)麻風(fēng)病患者和正常對(duì)照血清外泌體進(jìn)行分析,尋找有差異表達(dá)的代謝分子,繪制ROC曲線評(píng)估其診斷效力。5.利用蛋白質(zhì)譜方法對(duì)麻風(fēng)病患者和正常對(duì)照血清外泌體進(jìn)行檢測(cè)分析,尋找有差異表達(dá)的代謝分子,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,病繪制ROC曲線評(píng)估其診斷效力。結(jié)果:1.通過(guò)miRNA芯片(T-lep患者10例、L-lep患者10例、2型麻風(fēng)反應(yīng)患者10例、正常對(duì)照人員10例)檢測(cè)并擴(kuò)大樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR4485-3p(p0.01)和miR1227-5p(p0.05)在麻風(fēng)病患者中表達(dá)水平高于正常對(duì)照,且其均在L-lep中表達(dá)高于T-lep,前者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線下面積顯示miR1227-5p為 0.648(p=0.048),miR4485-3p 為 0.747(p=0.001),通過(guò) logistic 二元回歸模型以兩者預(yù)測(cè)概率值繪制的ROC曲線下面積為0.788(p0.001)。對(duì)其進(jìn)行靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè),miR4485-3p在L-lep中對(duì)RAP2B,HPSE,SLC11A,TLR4基因有顯著調(diào)控作用,在T-lep中是CD40LG;miR1227-5p在L-lep中對(duì)APOC1,CD5L,SLC11A1 有顯著調(diào)控,在 T-lep 中是 CYP27B1,S100B。GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)miR4485-3p的通路富集為巨噬細(xì)胞激活涉及的免疫應(yīng)答通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路,miR1227-5p是骨骼肌肉組織發(fā)育陽(yáng)性通路,細(xì)胞色素P450酶對(duì)外源生物代謝作用通路,花生四烯酸代謝通路。2.在巨噬細(xì)胞(人單核/巨噬細(xì)胞和THP1細(xì)胞)構(gòu)建體外麻風(fēng)菌感染模型中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清外泌體和細(xì)胞中miR4485-3p在兩者中均有顯著上調(diào)表達(dá),且有時(shí)間和菌濃度依賴性,以內(nèi)參miR16-5p作為對(duì)照并未發(fā)現(xiàn)明顯變化。3.在麻風(fēng)菌單核/巨噬細(xì)胞感染體系中轉(zhuǎn)染miR4485-3p模擬物并共培育自體T細(xì)胞以及添加IL10發(fā)現(xiàn),miR4485-3p通過(guò)靶向抑制CD4+T細(xì)胞表面CD40L受體,從而進(jìn)一步下調(diào)巨噬細(xì)胞表面CD40表達(dá)從而抑制巨噬細(xì)胞的活性,其表面活化性受體CD86出現(xiàn)下調(diào),相關(guān)細(xì)胞因子TNFa,IL1B,IL6表達(dá)下降,增加了巨噬細(xì)胞凋亡,保持細(xì)菌的活力,而抑制物轉(zhuǎn)染可觀察到相反作用。4.對(duì)麻風(fēng)患者(T-lep型患者6例,L-lep患者7例,T1LR型患者6例,T2LR型患者3例,正常對(duì)照6例)血清外泌體非靶向代謝組學(xué)研究共鑒定了 2109個(gè)化合物,根據(jù)(FC2,P0.01)篩選出各組別中均上調(diào)的代謝物是CerP(d18:1/24:1(15Z)),PC(24:1(15Z)/14:1(9Z)),PS(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/16:0),TG(24:1(15Z)/15:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)),PS(MonoMe(13,5)/MonoMe(13,5)),而下調(diào)的化合物是2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine。而根據(jù)樣本中含量(強(qiáng)度)繪制ROC曲線顯示前三個(gè)高表達(dá)的代謝物曲線下面積分別是0.917(p=0.002),0.992(p=0.000),0.939(p=0.001)而唯一的下調(diào)表達(dá)化合物曲線下面積為0.242(p=0.57)。而對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行同類別歸納分析發(fā)現(xiàn)PC,PS,PI,TG,DG類脂質(zhì)在疾病組均高表達(dá),且PE,PS,TG,DG在T1LR中表達(dá)顯著升高,PC,PE,CE在T-lep和L-lep中有顯著差異。5.通過(guò)對(duì)麻風(fēng)病患者(T-lep 6例,L-lep 7例,T1LR患者5例,T2LR患者4例,正常對(duì)照7例)血清外泌體蛋白組學(xué)研究共檢測(cè)到的1767個(gè)蛋白分子,根據(jù)FC2(或1/2)和p0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)T-lep與正常對(duì)照比有86個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白,65個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白;而L-lep中上調(diào)83個(gè)蛋白,下調(diào)59個(gè)蛋白;T1LR中上調(diào)68個(gè)蛋白,下調(diào)118個(gè)蛋白;T2LR中上調(diào)63個(gè)蛋白,下調(diào)102個(gè)蛋白。而其中D9YZU5(HBB)在所有疾病組中均有升高,以不同樣本蛋白含量繪制ROC曲線顯示包含反應(yīng)組曲線下面積0.740(p=0.059),不包含反應(yīng)組別為0.78(p=0.043),而CD5L分子在疾病組中明顯下降,在T-lep和反應(yīng)組(尤其T1LR)中下降顯著。結(jié)論:1.血清外泌體miR4485-3p有成為麻風(fēng)病診斷生物標(biāo)志物潛力。2.麻風(fēng)感染巨噬細(xì)胞后,可通過(guò)外泌體靶向運(yùn)送miR4485-3p調(diào)控CD4+T細(xì)胞表面CD40L受體,同時(shí)在IL10協(xié)同作用下反饋性抑制其功能。3.非靶向代謝化合物 CerP(d18:1/24:1(15Z)),PC(24:1(15Z)/14:1(9Z)),PS(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/16:0)有成為麻風(fēng)病診斷生物標(biāo)志物的可能。4.T-lep和L-lep中上調(diào)蛋白明顯多于上調(diào)蛋白,而T1LR和T2LR中下調(diào)蛋白更多,HBB可在麻風(fēng)患者中升高,推測(cè)其有成為診斷標(biāo)志物可能,CD5L在麻風(fēng)病患者中表達(dá)下降,在T-lep和反應(yīng)組別中顯著,可能成為少菌型診斷標(biāo)志物,亦可能成為麻風(fēng)反應(yīng)預(yù)測(cè)性分子。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R755
【部分圖文】：

封裝在外泌體中，細(xì)胞內(nèi)體聚集形成多囊泡體，然后再通過(guò)外泌方式將同時(shí)承載??巨噬細(xì)胞和結(jié)核桿菌分子的胞外小體排出細(xì)胞，通過(guò)釋放外泌體的內(nèi)容物，介導(dǎo)??細(xì)胞間的通訊，改變受體細(xì)胞（巨噬細(xì)胞／樹突狀細(xì)胞）的信號(hào)通路（圖２）?［３１］。??從感染細(xì)胞釋放分枝桿菌外泌體，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該外泌體的膜表??面具有ＭＨＣ－ＩＩ、熱休克蛋白７０?（Ｈｓｐ７０）、溶酶體相關(guān)膜蛋白１?（ＬＡＭＰ１）和分??枝桿菌抗原相關(guān)的模式分子（ＰＡＭＰｓ），這些分子在分枝桿菌抗原遞呈中具有??極其重要的作用；進(jìn)一步地研究也證實(shí)這些胞外小體可在體外特異地激活ＣＤ４＋??ＢＴ１??

圖３血清外泌體提取結(jié)果??（２）血清外泌體透射電鏡檢測(cè)可見提取的血清外泌體溶富含直徑３０－１００ｎｍ??

圖４外泌體透射電鏡分析??溶液經(jīng)粒徑儀觀察到囊泡的平均最大亮度較均勻，雜質(zhì)較少（右下為視頻？？？？？？？息?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?＆?Ｂｒｏｗｎｉａｎ＊＊？?＾?＿?．?＿?？?＊?????Ｖｉｄｅｏ?Ａｎａｌｙｓｉｓ??ＰＡ?Ｒ丁?Ｉ?［?Ｌ?￡?＝?Ｅｌ丁?Ｒ?１?Ｘ?Ｌａｓｅｒ?Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ?ＭｉｃｒｏｓＯｐｅｒａｔｏｒ?（Ｒｅｐｏｒｔ）：?ＺｅｉａＶｉｅｗ??Ｖｔａｅｒｏ?Ｏｐｅｒａｔｏｒ：?ＺｅｔａＶｉｅｗ??
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本文編號(hào)：2879087