第一部分漢族人銀屑病易感位點(diǎn)PSORS1精細(xì)定位 第一章漢族人銀屑病易感位點(diǎn)PSORS1精細(xì)定位——基于關(guān)聯(lián)分析 背景:銀屑病是一種皮膚科常見復(fù)雜疾病。本課題組先前對(duì)61個(gè)中國漢族尋常型銀屑病家系進(jìn)行了全基因組掃描,在6p21區(qū)域獲得強(qiáng)連鎖信號(hào)(最大NPL值=4.58,p=0.000032),此位點(diǎn)是漢族人尋常型銀屑病最主要的易感基因位點(diǎn),即PSORS1。該位點(diǎn)在不同的全基因組掃描研究中多次被證實(shí),是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前許多研究工作都在努力將其定位到染色體上更小的區(qū)域內(nèi)。 目的:在中國漢族人群中對(duì)位于6號(hào)染色體短臂上的銀屑病易感基因位點(diǎn)PSORS1進(jìn)行精細(xì)定位,從而為搜尋及鑒定該區(qū)域內(nèi)銀屑病易感基因奠定基礎(chǔ)。 方法:采用我們?cè)榷ㄎ籔SORS1位點(diǎn)內(nèi)最高峰D6S1645標(biāo)記附近選擇的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,在163個(gè)尋常型銀屑病家系和192個(gè)銀屑病散發(fā)病例及192個(gè)健康對(duì)照中進(jìn)行基因分型。然后采用單個(gè)位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析及基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析方法定位漢族人銀屑病PSORS1最小區(qū)域。 結(jié)果:關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(M6S187、C2_4_5、C2_4_4、C1_3_2、C1_2_6、M6S172和D6S273)與銀屑病相關(guān)(p10~(-3),OR1.5),跨越范圍731 kb�；诩蚁档年P(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(M6S187、C2_4_5、C2_4_4、C1_3_2和M6S172)與銀屑病相關(guān)(TDT p10-3),但標(biāo)記C1_2_6與銀屑病弱相關(guān)(p=0.0437)。單倍型分析顯示有四類常見單倍型與銀屑病相關(guān)(P0.0001),這四類危險(xiǎn)單倍型在HLA-B和標(biāo)記M6S187之間有約369-kb的一致性等位片段區(qū)域。其中PSORS1位點(diǎn)內(nèi)的主要候選基因HLA-Cw6和CDSN均包括在內(nèi)。 結(jié)論:漢族人尋常型銀屑病PSORS1易感基因位于HLA-B基因端粒端和標(biāo)記M6S187著絲粒端約369-kb的范圍內(nèi),其中包括HLA-C和CDSN等11個(gè)基因。 第二章銀屑病PSORS1關(guān)鍵區(qū)域重組單倍型定位——基于重組單倍型分析 背景:PSORS1作為銀屑病最主要的易感基因位點(diǎn)已得到了諸多研究的證實(shí),歐洲和美國學(xué)者對(duì)銀屑病的精細(xì)定位研究提示了一個(gè)約300-kb的候選區(qū)域,我們采用基于關(guān)聯(lián)分析的精細(xì)定位,將漢族人銀屑病PSORS1易感基因區(qū)域縮小到約369-kb,此范圍與白種人定位的區(qū)域一致,有待于進(jìn)一步定位關(guān)鍵區(qū)域及進(jìn)行易感基因搜尋。白種人中最近一項(xiàng)對(duì)其定位區(qū)域的易感基因研究提示HLA-Cw6很有可能是PSORS1易感基因。 目的:進(jìn)一步縮小漢族人銀屑病PSORS1的關(guān)鍵區(qū)域并確定可能的易感基因。 方法:選擇HLA-C和CDSN基因附近的5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記及兩個(gè)基因,共同構(gòu)建單倍型在163個(gè)銀屑病家系中進(jìn)行重組單倍型定位,使用TDT檢驗(yàn)對(duì)分別攜帶不同危險(xiǎn)等位基因的HLA-C及CDSN重組單倍型的檢測區(qū)域進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。 結(jié)果:163個(gè)家系中8個(gè)標(biāo)記的單倍型(HLA-B、HLA-C、CDSN和5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記)分析顯示重組區(qū)域都分布在兩個(gè)基因間148-kb的區(qū)域內(nèi),大多數(shù)的重組熱點(diǎn)(95%)位于M6S172和C1_3_2間92-kb的區(qū)域內(nèi)。HLA-Cw6陽性重組單倍型數(shù)目罕見,由于沒有足夠統(tǒng)計(jì)效力,未檢測到其與銀屑病的關(guān)聯(lián)(T:NT = 3:6)。所有的HLA-Cw6陰性重組單倍型都與銀屑病不相關(guān)。CDSN*TTC陽性重組單倍型包括C1_2_6–C2_4_5的檢測區(qū)域與銀屑病不相關(guān)(T:NT=25:42,p=0.0379),排除分析法將漢族人銀屑病PSORS1易感基因位點(diǎn)縮小到從HLA-C到C1_2_6約86-kb的區(qū)域內(nèi),僅包括兩個(gè)已知基因HLA-C和HCG27。 結(jié)論:重組單倍型定位結(jié)果支持HLA-C作為漢族人銀屑病PSORS1易感基因。 第二部分PSORS1區(qū)域內(nèi)銀屑病候選基因HLA-Cw6和CDSN研究 第一章HLA-Cw6和CDSN基因與銀屑病相關(guān)性研究 背景:本課題在對(duì)銀屑病PSORS1精細(xì)定位研究中,將該易感基因位點(diǎn)定位到369-kb的區(qū)域,包括11個(gè)已知基因。在進(jìn)一步的重組單倍型定位中將PSORS1易感基因關(guān)鍵區(qū)域縮小到僅約86kb的區(qū)域內(nèi),此區(qū)域內(nèi)HLA-C和HCG27兩個(gè)已知基因。HLA-C是銀屑病PSORS1最主要的候選基因,而諸多研究證實(shí)HCG27基因與銀屑病不相關(guān)。CDSN基因也是銀屑病PSORS1另一主要的候選基因,最近一項(xiàng)研究顯示PSORS1位點(diǎn)內(nèi)僅有這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA及編碼的蛋白與銀屑病發(fā)病相關(guān)。 目的:研究HLA-C和CDSN基因多態(tài)性與漢族人銀屑病易感性之間的相關(guān)性。方法:HLA-C基因分型采用PCR-SBT法,CDSN基因采用直接測序法在228個(gè)家系所有樣本中進(jìn)行基因分型,對(duì)兩個(gè)基因在所有家系樣本中構(gòu)建單倍型并進(jìn)行與銀屑病相關(guān)性的關(guān)聯(lián)分析。 結(jié)果:TDT檢驗(yàn)結(jié)果顯示HLA-Cw6和CDSN*TTC都與銀屑病顯著相關(guān)(1.439×10~(-18)與1.658×10~(-8) TDT p值)。在228個(gè)銀屑病家系中構(gòu)建HLA-C-CDSN單倍型,結(jié)果顯示在990個(gè)奠基者的染色體中共有160個(gè)單倍型分別攜帶HLA-C及CDSN的危險(xiǎn)等位基因。HLA-Cw6+/CDSN*TTC+單倍型是最常見的類型(單倍型頻率31.7%),與銀屑病強(qiáng)相關(guān)(T:NT = 128:24)。而HLA-Cw6-/CDSN*TTC+(單倍型頻率14.9%)和HLA-Cw6-/CDSN*TTC-(單倍型頻率50.0%)與銀屑病不相關(guān)(T:NT分別為30:58和38:111)。HLA-Cw6+/CDSN*TTC-單倍型少見(單倍型頻率3.4%) ,未檢測到與銀屑病相關(guān)(T:NT = 5:8)。 結(jié)論:HLA-C和CDSN基因與銀屑病顯著相關(guān),但HLA-C與銀屑病關(guān)聯(lián)更強(qiáng);由于僅攜帶CDSN*TTC的重組單倍型為銀屑病保護(hù)因素,因此CDSN基因不是漢族人銀屑病PSORS1的易感基因。 第二章銀屑病HLA-Cw*0602陽性與陰性患者臨床特征的比較 背景:現(xiàn)在已普遍認(rèn)為銀屑病是一種由多個(gè)基因和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病,PSORS1是唯一經(jīng)多個(gè)研究小組(包括本研究小組)證實(shí)的位點(diǎn)。其中HLA-Cw*0602基因被證實(shí)與銀屑病相關(guān)性最強(qiáng),是PSORS1區(qū)域的主要侯選基因。HLA-Cw*0602陽性與陰性銀屑病患者之間有著不全相同的臨床特征。 目的:比較漢族人銀屑病HLA-Cw*0602陽性與陰性患者臨床特征的差異。 方法:收集了679例銀屑病患者,其中有家族史患者451例,散發(fā)病例228例。正常對(duì)照384例。將所有患者通過基因分型分為HLA-Cw*0602陽性與陰性兩組。比較兩組臨床特征差異,如年齡,性別,發(fā)病年齡,病程,臨床表型,發(fā)病部位,疾病嚴(yán)重程度,發(fā)病前咽喉部感染史,Koebner's phenomenon,外傷等因素。 結(jié)果:⑴Cw*0602陽性患者(n=345)平均發(fā)病年齡較早(p1×10-5),病情較重(p1×10-3),其中急性點(diǎn)滴型銀屑病患者較多(p1×10-9),受累部位多為小腿和軀干(p1×10-5),Kobner’s現(xiàn)象(p=0.005)及外傷史(p=0.009)發(fā)生的頻率較高。⑵Cw*0602陰性組(n=334)掌跖膿皰型銀屑病的發(fā)生率(p=0.004)較高,甲及頭皮受累更多見(p=0.001和p=0.007)。⑶兩組間在年齡、性別、斑塊型、紅皮病型、反轉(zhuǎn)型及關(guān)節(jié)病型銀屑病發(fā)生率及感染和精神壓力等環(huán)境因素等方面均沒有顯著性差異。 結(jié)論:中國漢族人銀屑病HLA-Cw*0602陽性與陰性患者臨床特征存在一些明顯的差異,為與HLA-Cw*0602相關(guān)的銀屑病表型研究提供了證據(jù)。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R758.63
【部分圖文】：

圖 1. PCR 產(chǎn)物 1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖像（右側(cè)是 Marker）Fig 1. electrophoresis image of the PCR product4、微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記的分型4.1 微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記的選擇：通過文獻(xiàn)檢索和參照 NCBI 數(shù)據(jù)庫物理圖譜，構(gòu)建了染色體 6q21.3 區(qū)域內(nèi)及其周邊所有已知微衛(wèi)星標(biāo)記的詳細(xì)數(shù)據(jù)庫，這套高密度的微衛(wèi)星標(biāo)記由Tamiya1998 年建立，見表 2。表 2. 6 號(hào)染色體上微衛(wèi)星標(biāo)記信息表Table 2. The information of microsatellte markers on chromosome 6p21.3markers 物理距離 Genethon Size Repeat Het NotesD6S46090 144-16681D6S1575 41255583-4125568460.7 88-11082D6S1562 40383224-4038350358.2 280-2966553.9 117-143

圖 3 STR 基因分型圖Fig 3 The genotyping result of fluorescent microsatellite markers微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記數(shù)據(jù)處理： 數(shù)據(jù)的收集和分析軟件利用如下軟件機(jī)器進(jìn)行自動(dòng)電泳、數(shù)據(jù)收集、DNA 片段大小計(jì)算和基因分ABI PRISM@3730 Collection Software, version 2.0ABI PRISM Run ModulesGeneMapper@Analysis software, version 4.0 數(shù)據(jù)的采集 上樣結(jié)束后，測序儀會(huì)自動(dòng)電泳和數(shù)據(jù)收集，電泳完成后自動(dòng)生成 96 個(gè)樣品數(shù)據(jù)文件。 從主機(jī)下載原始數(shù)據(jù)。 將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為軟件可識(shí)別文件。

5.3 數(shù)據(jù)的校對(duì)所有樣品的基因分型結(jié)果都必須經(jīng)過人工仔細(xì)校對(duì)。首先用 PedCheck 軟的 Checkped.exe 程序檢查每個(gè)家系成員的分型結(jié)果是否符合孟德爾遺傳規(guī)后采用 Merlin 軟件排列家系內(nèi)單倍型，如果某一染色體區(qū)域內(nèi)發(fā)生兩次以上提示該家系個(gè)體處的遺傳標(biāo)記分型肯定存在錯(cuò)誤[29]，如圖 4。對(duì)于此家系，仔細(xì)審核其原始數(shù)據(jù)或者對(duì)有疑問的基因分型結(jié)果重新 PCR 并分型。由于糾錯(cuò)能力較低，只能檢查出那些不符合孟德爾遺傳規(guī)律的分型結(jié)果。另外種因素的影響都有可能造成基因分型的錯(cuò)誤，比如說實(shí)驗(yàn)操作誤差、家系標(biāo)記的雜合度低、儀器識(shí)別誤差等因素。5.4 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備將所有數(shù)據(jù)校對(duì)好后，分別用 Linkage 軟件包中的 table2pre.exe、pre2和 makeped.exe 程序?qū)⑵滢D(zhuǎn)化成其他分析軟件能夠處理的文件。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 趙桐茂;骨髓庫和臍血庫中的HLA分型技術(shù)和策略[J];中國輸血雜志;2001年06期

2 楊森,魏生才,張學(xué)軍,陳珊宇,王紅艷;尋常型銀屑病誘因流行病學(xué)研究[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2000年03期

3 蘭炯采,孫倩,陳強(qiáng),張志梅,曹瓊,夏榮,武大林,吳濤;臍帶血HLAⅠ類定型研究[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2001年03期

本文編號(hào)：2849199