第一部分漢族人銀屑病易感位點PSORS1精細定位 第一章漢族人銀屑病易感位點PSORS1精細定位——基于關聯(lián)分析 背景:銀屑病是一種皮膚科常見復雜疾病。本課題組先前對61個中國漢族尋常型銀屑病家系進行了全基因組掃描,在6p21區(qū)域獲得強連鎖信號(最大NPL值=4.58,p=0.000032),此位點是漢族人尋常型銀屑病最主要的易感基因位點,即PSORS1。該位點在不同的全基因組掃描研究中多次被證實,是當前的研究熱點。目前許多研究工作都在努力將其定位到染色體上更小的區(qū)域內(nèi)。 目的:在中國漢族人群中對位于6號染色體短臂上的銀屑病易感基因位點PSORS1進行精細定位,從而為搜尋及鑒定該區(qū)域內(nèi)銀屑病易感基因奠定基礎。 方法:采用我們原先定位PSORS1位點內(nèi)最高峰D6S1645標記附近選擇的10個微衛(wèi)星標記,在163個尋常型銀屑病家系和192個銀屑病散發(fā)病例及192個健康對照中進行基因分型。然后采用單個位點關聯(lián)分析及基于單倍型的關聯(lián)分析方法定位漢族人銀屑病PSORS1最小區(qū)域。 結果:關聯(lián)分析結果顯示7個微衛(wèi)星標記(M6S187、C2_4_5、C2_4_4、C1_3_2、C1_2_6、M6S172和D6S273)與銀屑病相關(p10~(-3),OR1.5),跨越范圍731 kb�；诩蚁档年P聯(lián)分析結果顯示5個微衛(wèi)星標記(M6S187、C2_4_5、C2_4_4、C1_3_2和M6S172)與銀屑病相關(TDT p10-3),但標記C1_2_6與銀屑病弱相關(p=0.0437)。單倍型分析顯示有四類常見單倍型與銀屑病相關(P0.0001),這四類危險單倍型在HLA-B和標記M6S187之間有約369-kb的一致性等位片段區(qū)域。其中PSORS1位點內(nèi)的主要候選基因HLA-Cw6和CDSN均包括在內(nèi)。 結論:漢族人尋常型銀屑病PSORS1易感基因位于HLA-B基因端粒端和標記M6S187著絲粒端約369-kb的范圍內(nèi),其中包括HLA-C和CDSN等11個基因。 第二章銀屑病PSORS1關鍵區(qū)域重組單倍型定位——基于重組單倍型分析 背景:PSORS1作為銀屑病最主要的易感基因位點已得到了諸多研究的證實,歐洲和美國學者對銀屑病的精細定位研究提示了一個約300-kb的候選區(qū)域,我們采用基于關聯(lián)分析的精細定位,將漢族人銀屑病PSORS1易感基因區(qū)域縮小到約369-kb,此范圍與白種人定位的區(qū)域一致,有待于進一步定位關鍵區(qū)域及進行易感基因搜尋。白種人中最近一項對其定位區(qū)域的易感基因研究提示HLA-Cw6很有可能是PSORS1易感基因。 目的:進一步縮小漢族人銀屑病PSORS1的關鍵區(qū)域并確定可能的易感基因。 方法:選擇HLA-C和CDSN基因附近的5個微衛(wèi)星標記及兩個基因,共同構建單倍型在163個銀屑病家系中進行重組單倍型定位,使用TDT檢驗對分別攜帶不同危險等位基因的HLA-C及CDSN重組單倍型的檢測區(qū)域進行關聯(lián)分析。 結果:163個家系中8個標記的單倍型(HLA-B、HLA-C、CDSN和5個微衛(wèi)星標記)分析顯示重組區(qū)域都分布在兩個基因間148-kb的區(qū)域內(nèi),大多數(shù)的重組熱點(95%)位于M6S172和C1_3_2間92-kb的區(qū)域內(nèi)。HLA-Cw6陽性重組單倍型數(shù)目罕見,由于沒有足夠統(tǒng)計效力,未檢測到其與銀屑病的關聯(lián)(T:NT = 3:6)。所有的HLA-Cw6陰性重組單倍型都與銀屑病不相關。CDSN*TTC陽性重組單倍型包括C1_2_6–C2_4_5的檢測區(qū)域與銀屑病不相關(T:NT=25:42,p=0.0379),排除分析法將漢族人銀屑病PSORS1易感基因位點縮小到從HLA-C到C1_2_6約86-kb的區(qū)域內(nèi),僅包括兩個已知基因HLA-C和HCG27。 結論:重組單倍型定位結果支持HLA-C作為漢族人銀屑病PSORS1易感基因。 第二部分PSORS1區(qū)域內(nèi)銀屑病候選基因HLA-Cw6和CDSN研究 第一章HLA-Cw6和CDSN基因與銀屑病相關性研究 背景:本課題在對銀屑病PSORS1精細定位研究中,將該易感基因位點定位到369-kb的區(qū)域,包括11個已知基因。在進一步的重組單倍型定位中將PSORS1易感基因關鍵區(qū)域縮小到僅約86kb的區(qū)域內(nèi),此區(qū)域內(nèi)HLA-C和HCG27兩個已知基因。HLA-C是銀屑病PSORS1最主要的候選基因,而諸多研究證實HCG27基因與銀屑病不相關。CDSN基因也是銀屑病PSORS1另一主要的候選基因,最近一項研究顯示PSORS1位點內(nèi)僅有這兩個基因轉錄的mRNA及編碼的蛋白與銀屑病發(fā)病相關。 目的:研究HLA-C和CDSN基因多態(tài)性與漢族人銀屑病易感性之間的相關性。方法:HLA-C基因分型采用PCR-SBT法,CDSN基因采用直接測序法在228個家系所有樣本中進行基因分型,對兩個基因在所有家系樣本中構建單倍型并進行與銀屑病相關性的關聯(lián)分析。 結果:TDT檢驗結果顯示HLA-Cw6和CDSN*TTC都與銀屑病顯著相關(1.439×10~(-18)與1.658×10~(-8) TDT p值)。在228個銀屑病家系中構建HLA-C-CDSN單倍型,結果顯示在990個奠基者的染色體中共有160個單倍型分別攜帶HLA-C及CDSN的危險等位基因。HLA-Cw6+/CDSN*TTC+單倍型是最常見的類型(單倍型頻率31.7%),與銀屑病強相關(T:NT = 128:24)。而HLA-Cw6-/CDSN*TTC+(單倍型頻率14.9%)和HLA-Cw6-/CDSN*TTC-(單倍型頻率50.0%)與銀屑病不相關(T:NT分別為30:58和38:111)。HLA-Cw6+/CDSN*TTC-單倍型少見(單倍型頻率3.4%) ,未檢測到與銀屑病相關(T:NT = 5:8)。 結論:HLA-C和CDSN基因與銀屑病顯著相關,但HLA-C與銀屑病關聯(lián)更強;由于僅攜帶CDSN*TTC的重組單倍型為銀屑病保護因素,因此CDSN基因不是漢族人銀屑病PSORS1的易感基因。 第二章銀屑病HLA-Cw*0602陽性與陰性患者臨床特征的比較 背景:現(xiàn)在已普遍認為銀屑病是一種由多個基因和環(huán)境因素共同作用所致的復雜疾病,PSORS1是唯一經(jīng)多個研究小組(包括本研究小組)證實的位點。其中HLA-Cw*0602基因被證實與銀屑病相關性最強,是PSORS1區(qū)域的主要侯選基因。HLA-Cw*0602陽性與陰性銀屑病患者之間有著不全相同的臨床特征。 目的:比較漢族人銀屑病HLA-Cw*0602陽性與陰性患者臨床特征的差異。 方法:收集了679例銀屑病患者,其中有家族史患者451例,散發(fā)病例228例。正常對照384例。將所有患者通過基因分型分為HLA-Cw*0602陽性與陰性兩組。比較兩組臨床特征差異,如年齡,性別,發(fā)病年齡,病程,臨床表型,發(fā)病部位,疾病嚴重程度,發(fā)病前咽喉部感染史,Koebner's phenomenon,外傷等因素。 結果:⑴Cw*0602陽性患者(n=345)平均發(fā)病年齡較早(p1×10-5),病情較重(p1×10-3),其中急性點滴型銀屑病患者較多(p1×10-9),受累部位多為小腿和軀干(p1×10-5),Kobner’s現(xiàn)象(p=0.005)及外傷史(p=0.009)發(fā)生的頻率較高。⑵Cw*0602陰性組(n=334)掌跖膿皰型銀屑病的發(fā)生率(p=0.004)較高,甲及頭皮受累更多見(p=0.001和p=0.007)。⑶兩組間在年齡、性別、斑塊型、紅皮病型、反轉型及關節(jié)病型銀屑病發(fā)生率及感染和精神壓力等環(huán)境因素等方面均沒有顯著性差異。 結論:中國漢族人銀屑病HLA-Cw*0602陽性與陰性患者臨床特征存在一些明顯的差異,為與HLA-Cw*0602相關的銀屑病表型研究提供了證據(jù)。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R758.63
【部分圖文】：

圖 1. PCR 產(chǎn)物 1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖像（右側是 Marker）Fig 1. electrophoresis image of the PCR product4、微衛(wèi)星多態(tài)標記的分型4.1 微衛(wèi)星多態(tài)標記的選擇：通過文獻檢索和參照 NCBI 數(shù)據(jù)庫物理圖譜，構建了染色體 6q21.3 區(qū)域內(nèi)及其周邊所有已知微衛(wèi)星標記的詳細數(shù)據(jù)庫，這套高密度的微衛(wèi)星標記由Tamiya1998 年建立，見表 2。表 2. 6 號染色體上微衛(wèi)星標記信息表Table 2. The information of microsatellte markers on chromosome 6p21.3markers 物理距離 Genethon Size Repeat Het NotesD6S46090 144-16681D6S1575 41255583-4125568460.7 88-11082D6S1562 40383224-4038350358.2 280-2966553.9 117-143

圖 3 STR 基因分型圖Fig 3 The genotyping result of fluorescent microsatellite markers微衛(wèi)星多態(tài)標記數(shù)據(jù)處理： 數(shù)據(jù)的收集和分析軟件利用如下軟件機器進行自動電泳、數(shù)據(jù)收集、DNA 片段大小計算和基因分ABI PRISM@3730 Collection Software, version 2.0ABI PRISM Run ModulesGeneMapper@Analysis software, version 4.0 數(shù)據(jù)的采集 上樣結束后，測序儀會自動電泳和數(shù)據(jù)收集，電泳完成后自動生成 96 個樣品數(shù)據(jù)文件。 從主機下載原始數(shù)據(jù)。 將原始數(shù)據(jù)轉換為軟件可識別文件。

5.3 數(shù)據(jù)的校對所有樣品的基因分型結果都必須經(jīng)過人工仔細校對。首先用 PedCheck 軟的 Checkped.exe 程序檢查每個家系成員的分型結果是否符合孟德爾遺傳規(guī)后采用 Merlin 軟件排列家系內(nèi)單倍型，如果某一染色體區(qū)域內(nèi)發(fā)生兩次以上提示該家系個體處的遺傳標記分型肯定存在錯誤[29]，如圖 4。對于此家系，仔細審核其原始數(shù)據(jù)或者對有疑問的基因分型結果重新 PCR 并分型。由于糾錯能力較低，只能檢查出那些不符合孟德爾遺傳規(guī)律的分型結果。另外種因素的影響都有可能造成基因分型的錯誤，比如說實驗操作誤差、家系標記的雜合度低、儀器識別誤差等因素。5.4 數(shù)據(jù)準備將所有數(shù)據(jù)校對好后，分別用 Linkage 軟件包中的 table2pre.exe、pre2和 makeped.exe 程序?qū)⑵滢D化成其他分析軟件能夠處理的文件。
【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 趙桐茂;骨髓庫和臍血庫中的HLA分型技術和策略[J];中國輸血雜志;2001年06期

2 楊森,魏生才,張學軍,陳珊宇,王紅艷;尋常型銀屑病誘因流行病學研究[J];中國麻風皮膚病雜志;2000年03期

3 蘭炯采,孫倩,陳強,張志梅,曹瓊,夏榮,武大林,吳濤;臍帶血HLAⅠ類定型研究[J];中國實驗血液學雜志;2001年03期

本文編號：2849199