目的:人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染是一組皮膚科臨床常見疾病。作為一種接觸性傳播疾病,HPV感染對廣大勞動人民的健康和生活質量造成了一定的損害。同時,作為一種常見的性傳播疾病,HPV感染也在患者精神和社會層面上產生了諸多不良影響。因此,如何有效地阻斷HPV病毒的傳播,治療HPV病毒感染性疾病成了皮膚科的一項重要臨床任務。現(xiàn)階段,應對HPV感染性皮膚病的傳統(tǒng)治療手段(如冷凍、激光、光動力療法等)均存在治療過程痛苦、復發(fā)率高或治療成本高昂等缺點。而一種新興的局部溫熱療法在保證較高治愈率的前提下還具有無痛苦、低復發(fā)率、無特殊禁忌癥、多位點治療效應等優(yōu)勢,已成為一種良好的HPV感染替代治療方案。本研究從溫熱效應和熱休克蛋白對人類角質形成細胞的影響入手,進一步探索局部溫熱治療HPV感染的內在機制,并為找尋溫熱干預靶點,提升療效,縮短治療周期,減少復發(fā)率等方面提供更多的思路。研究方法:本研究選用人類角質形成細胞或組織(HaCaT細胞系,包皮組織和尖銳濕疣疣體組織)作為研究對象,其中包皮組織來源于臨床包皮環(huán)切術患者切除的包皮組織,尖銳濕疣疣體來源于臨床行病理檢查患者切除的多余疣體組織。疾病組織由病理診斷確定,相關實驗方案經由中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。研究采用44(±0.1)℃水浴體外加熱方法模擬臨床溫熱治療,探究溫熱治療對角質形成細胞的影響。細胞或組織中蛋白質譜表達情況使用iTRAQ標記或SILAC標記的蛋白質譜檢測技術進行定量;mRNA表達水平使用基于SYBR染料法的實時熒光定量PCR技術進行測定;蛋白質表達水平使用Western Blot技術進行檢測;蛋白質在組織中的表達與定位情況由免疫組織化學染色技術進行測定,而在細胞中的表達與定位情況則由免疫熒光染色技術進行測定;DNA核酸檢測使用瓊脂糖凝膠電泳進行分離與鑒定。對于細胞功能學檢測,細胞凋亡與細胞周期分布均使用流式細胞儀進行測定,而細胞增殖活性則使用MTS細胞增殖實驗檢測。溫熱及熱休克蛋白對角質形成細胞蛋白質乙酰化水平的影響由TMT標記的蛋白質譜檢測技術進行定量分析。統(tǒng)計分析方面,全部高通量數(shù)據(jù)均采用R語言(版本號3.4.1)平臺進行生物信息學計算分析;蛋白質相互作用網絡分析使用SRTING在線數(shù)據(jù)庫和Cytoscape(版本號3.5.1)軟件進行分析和繪制;細胞系來源數(shù)據(jù)均采用獨立樣本t檢驗或方差分析進行判斷,而組織來源數(shù)據(jù)均采用配對t檢驗進行分析,檢驗水準均為P0.05。除蛋白質互作網絡外,本研究其余圖片均使用R語言(版本號3.4.1)ggplot2軟件包繪制,并使用Photoshop 7.0軟件拼接。結果:1)44℃溫熱刺激造成HaCaT細胞中630個蛋白質產生差異表達(閾值1.3,P值0.05),其中上調蛋白質251個,下調蛋白質379個。上調蛋白質依照表達量可聚為4類,參與到細胞膜質運動、凋亡、應激反應、能量代謝、病毒與宿主相互作用與病毒感染調控中。而下調蛋白可聚為5類,分別參與到多種代謝途徑、病毒基因轉錄與表達、核糖體合成、核蛋白組裝、細胞周期調控等生物學過程中。蛋白質互作分析鑒定到591個節(jié)點共6167組相互作用關系,且上、下調網絡可各鑒定到4種主要互作模式,其執(zhí)行功能與聚類分析結果類似。對互作網絡的深入挖掘得到上、下調網絡中排名前十的節(jié)點蛋白,可作為未來研究靶點。2)44℃溫熱刺激造成了尖銳濕疣組織中102個蛋白質產生差異表達(閾值1.2,P值0.05),其中上調蛋白37個,下調蛋白65個。對質譜結果的驗證試驗證實,包括OAS1在內的10種差異蛋白mRNA表達水平呈現(xiàn)對應變化,而包括MX1在內的4種差異蛋白的蛋白質表達水平發(fā)生對應改變。聚類和富集分析發(fā)現(xiàn),上調蛋白質更多富集于抗原提呈和病毒防御反應之中,而下調蛋白主要富集于合成、分解代謝和角質形成細胞分化等過程之中。蛋白質互作網絡研究發(fā)現(xiàn)全部差異蛋白存在49個節(jié)點共68組相互作用關系的互作網絡,并可挖掘出兩種主要的互作模式。由互作網絡得到包含CETN2在內的13個節(jié)點蛋白質,可作為未來實驗分析重點。3)44℃溫熱刺激在多種來源的人角質形成細胞中均可誘導熱休克蛋白DNAJA4的表達,且表達情況呈現(xiàn)快速一過性變化,達峰時間在8小時左右,24小時可基本恢復基線水平。DNAJA4蛋白主要表達于表皮,在細胞內主要集中于胞質,且在靜息狀態(tài)下存在一定的基礎表達量。44℃溫熱刺激與DNAJA4基因缺失均可造成P65蛋白質的磷酸化,并促進下游基因轉錄,且該活化反應可被特異性抑制劑PDTC和Helenalin所阻斷。DNAJA4基因缺失降低了HaCaT細胞對44℃溫熱刺激的抵抗力,造成細胞死亡增加,S期比例下降,MTS增殖放緩,而這些效應可被PDTC部分阻斷。4)44℃溫熱刺激可在多種來源的人角質形成細胞中誘導熱休克蛋白HSPA6的表達,且表達亦呈現(xiàn)快速一過性變化,達峰時間約在4小時左右,24小時可恢復基線水平。HSPA6在靜息狀態(tài)下無表達或表達量極低,受溫熱刺激后主要表達于細胞質中。HSPA6基因缺失顯著地降低了HaCaT細胞對44℃的耐受能力,造成大量細胞凋亡和死亡,細胞周期分布顯著阻滯,MTS增殖活性下降。PCR芯片檢測結果顯示,HSPA6對人類抗病毒活性分子的轉錄具有雙向調節(jié)現(xiàn)象,對不同效應的分子產生不同的作用。5)44℃溫熱刺激造成HaCaT細胞中240個蛋白質共計311個賴氨酸位點乙�；揎椀母淖�(閾值1.5,P值0.05),其中乙�；险{蛋白質150個(194個位點),乙酰化下調蛋白90個(117個位點),其中有11個蛋白質同時存在乙�；稀⑾抡{改變。對乙�；揎椢稽c的氨基酸基序測定分析找到了包含GKK基序在內的15種主要的乙�；揎椈颉８患治鼋Y果顯示,乙�；险{蛋白質主要參與到病毒基因調控和端粒組裝,而乙�；抡{蛋白主要參與了P53信號轉導通路和組蛋白染色質相互作用。同時,乙�；�、下調的蛋白質均同時參與到了RNA的處理、運輸、代謝等生物學過程之中。6)44℃環(huán)境下,熱休克蛋白DNAJA4對HaCaT細胞中DNA調節(jié)、rRNA處理和代謝以及P53信號轉導通路中的蛋白質乙�；绊戄^小,而對凋亡、病毒核酸調控及mRNA剪切與代謝等過程中蛋白質乙�；绊戄^大。而熱休克蛋白HSPA6則對RNA剪切、處理及代謝,DNA復制,病毒復制與轉錄調控,以及P53信號通路等生物學過程中蛋白質的乙�；a生了較為明顯的影響。結論:1)在HPV陰性(HaCaT)或陽性(尖銳濕疣)角質形成細胞中,44℃溫熱刺激均可能造成了細胞物質或能量代謝過程的阻斷,抑制病毒核酸的復制或轉錄,同時提升了角質形成細胞的抗原提呈能力和抗病毒分子活性。這些分子變化可能是臨床局部溫熱療法治療HPV感染性疾病的重要分子基礎。2)熱休克蛋白DNAJA4通過NF-kappa B信號通路部分阻斷了44℃溫熱作用下HaCaT細胞凋亡、死亡比例上升,細胞周期S期下降,以及細胞增殖活性減弱的現(xiàn)象。3)44℃溫熱環(huán)境下,熱休克蛋白HSPA6為HaCaT細胞提供了重要的保護作用,有效地減少了細胞凋亡、死亡比例,防止細胞周期的阻斷,保護其增殖活性。同時,HSPA6還對44℃溫熱誘導的抗病毒活性分子產生雙向調節(jié)作用。4)在HaCaT細胞中,44℃溫熱刺激更趨于上調抗病毒活性分子乙�；�,下調染色質調控相關分子乙酰化水平,而對RNA代謝相關蛋白進行雙向調節(jié),并以此調控細胞的抗病毒反應活性。而熱休克蛋白DNAJA4與HSPA6均對HaCaT細胞上述生物學過程的蛋白質乙�；a生差異性影響,且HSPA6相比DNAJA4影響力更為顯著。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R759
【部分圖文】：

3 實驗結果1 溫熱刺激下 HaCaT 細胞蛋白質譜表達變化及生物信息學分析1.1 HaCaT 細胞受溫熱刺激后全局蛋白質譜變化檢測HaCaT 細胞分別分組為實驗組（44℃）和對照組（37℃），根據(jù)實驗方法所程完成三次獨立質譜檢測。質譜結果搜庫后共鑒定到 6670 個蛋白質，其中可蛋白質共 5307 個。以實驗組細胞質譜表達量/對照組細胞質譜表達量計算差異倍數(shù)，設定閾值為 1.3 倍（大于 1.3 或小于 0.769），且三次獨立實驗進行獨立 t 檢驗，規(guī)定統(tǒng)計學差異閾值為 p<0.05。最終，獲得滿足上述篩選條件的可定白 630 個，其中上調蛋白質 251 個，下調蛋白質 379 個。差異蛋白質豐度與置如圖 1 所示。

相對比對照組 HaCaT 細胞，溫熱處理造成了實驗組細胞核糖體生物合成、RNA 代謝、蛋白質內質網定位、病毒核酸調控、細胞周期調控等生物學過程（BiologicalProcess, BP）的改變。如圖 2A 所示，這些生物學過程主要涉及了 RNA 結合、核糖體結構、輔酶結合以及細胞骨架蛋白結合等關鍵分子功能（Molecular Function, MF）,從而影響了核糖體、胞內質膜系統(tǒng)、剪切體以及染色體等主要的細胞結構（CellularComponent, CC）。同時，對受溫熱刺激改變的全體蛋白質進行 KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）富集分析發(fā)現(xiàn)（圖 2B），近似于 GO 富集分析的結論，44℃溫熱刺激在 HaCaT 細胞中造成了對應的信號轉導通路改變。具體地，溫熱刺激造成了碳代謝、糖酵解與糖異生及氨基酸合成等代謝通路分子的變化；病毒致癌、人乳頭瘤病毒感染在內的多種病毒感染相關生理通路分子的改變；同時也造成了諸如緊密連接在內的細胞間粘附通路，內質網蛋白質處理在內的細胞內蛋白質定位等通路分子的變化。由此可見，總體上 44℃溫熱刺激在 HaCaT 細胞中主要造成了細胞代謝、蛋白質處理、細胞間相互作用、以及病毒生理相關的部分分子及其對應功能的改變。

17圖 3 44℃溫熱下 HaCaT 細胞上調差異蛋白的聚類分析與生理功能A 為上調蛋白質的層次聚類結果，Group1、2、3 分別表示三次獨立重復試驗中實驗組/對照組的蛋白質差異表達量。B 為上調蛋白質 K 均值聚類的結果，坐標軸代標不同蛋白質表達量數(shù)值距離差異，不同顏色代表不同的聚類群。C 為上調蛋白按照 K 均值聚類分組后 GO-BP 聚類分析結果，不同顏色代表對應的聚類群，Gene Count 代表參與到不同條目的基因個數(shù)，Enrichment Score 代表不同條目的富集程度。相似地，對下調差異蛋白進行聚類分析，由 gap statistic 法與 WSS 法聯(lián)立計算可推測最佳聚類數(shù)目為 5。依次對分層聚類進行對應剪枝（圖 4A），對 K 均值聚類取 K 值為 5（圖 4B）所得聚類結果近似。選取魯棒性更好的 K 均值聚類結果進行GO-BP 富集分析，可以發(fā)現(xiàn)下調蛋白的 5 個亞群分別參與到了核糖體生物合成、RNA 代謝與病毒核酸調控、核酸轉運和穩(wěn)定性調控、物質代謝、細胞周期調控等生物學過程之中（圖 4C）。

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本文編號：2824973