研究背景和目的IFNα與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后誘導(dǎo)干擾素刺激基因(ISGs)表達(dá)來發(fā)揮抗增殖,促凋亡,抗病毒等作用。去乙酰化酶(HDACs)通常與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān),但I(xiàn)型HDACs(HDAC1,2,3)卻是細(xì)胞IFN反應(yīng)性所必需的,具體的機(jī)制尚不清楚。一氧化氮(NO)由三種一氧化氮合酶(NOS1,NOS2,NOS3)催化生成,NOS在多種腫瘤中表達(dá)升高并促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。NO基團(tuán)能與蛋白質(zhì)特定半胱氨酸殘基上的巰醇結(jié)合,形成亞硝基硫醇共價(jià)鍵,稱為巰基亞硝基化(SNO),是NO發(fā)揮功能的主要方式之一。NOS/NO通過亞硝基化大量腫瘤相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤增殖、凋亡、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等功能。NO/NOS1能抑制腫瘤免疫,NOS1在黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá),且NOS1降低了外周血單核細(xì)胞對IFNα的反應(yīng)性,但具體的機(jī)制不清。HDAC2是NO亞硝化修飾的靶蛋白,NOS1是否通過亞硝化HDAC2參與了腫瘤細(xì)胞IFNα反應(yīng)性的調(diào)控還不清楚。本課題將探討NOS1對黑色素瘤干擾素反應(yīng)性的調(diào)控作用并闡明相關(guān)分子機(jī)制,為揭示黑色素瘤干擾素治療抵抗提供新思路。研究結(jié)果1.采用NO供體和NOS抑制劑處理黑色素瘤細(xì)胞株,初步得出NO參與了IFNα誘導(dǎo)的ISGs的表達(dá)調(diào)控,構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)NOS1的黑色素瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)證明,NOS1抑制了 IFNα誘導(dǎo)的ISGs的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。2.探討HDAC2在調(diào)控ISGs表達(dá)中的作用,利用siRNA和外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HDAC2的表達(dá)水平,并結(jié)合RT-PCR和pISRE熒光素酶報(bào)告基因等方法檢測,表明HDAC2促進(jìn)了ISGF3依賴性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。利用ChIP-qPCR方法分析顯示IFNα刺激誘導(dǎo)HDAC2向ISGs啟動子區(qū)招募,使組蛋白H4K16去乙酰化,進(jìn)而招募RNA聚合酶II與啟動子結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的ISGs表達(dá),同時(shí),HDAC2不影響H3和H4K5乙�；�3.我們通過“Biotin-Switch”,定點(diǎn)突變,Co-IP等方法,進(jìn)一步證實(shí)NOS1與HDAC2結(jié)合并亞硝基化HDAC2,NOS1通過亞硝化HDAC2的C262/C274位點(diǎn)并抑制其對H4K16的去乙�；蚏NA聚合酶II的招募,從而抑制了腫瘤細(xì)胞的ISGs表達(dá)。4.通過穩(wěn)定過表達(dá)NOS1的小鼠黑色素瘤細(xì)胞尾靜脈注射方式構(gòu)建小鼠肺轉(zhuǎn)移模型,結(jié)果表明NOS1可以促進(jìn)小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移,在過表達(dá)NOS1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入HDAC2點(diǎn)突變質(zhì)粒能逆轉(zhuǎn)NOS1的作用;黑色素瘤細(xì)胞中敲除HDAC2抑制了小鼠肺部腫瘤形成,在敲除HDAC2的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)野生型HDAC2和突變型HDAC2均可以恢復(fù)黑色素瘤肺部腫瘤形成,且HDAC2突變后部分程度上逆轉(zhuǎn)了黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。研究結(jié)論NOS1抑制黑色素瘤細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)的ISGs的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),IFNα刺激招募HDAC2到ISGs啟動子區(qū)并使組蛋白H4K16去乙酰化,促進(jìn)了 RNA聚合酶II與啟動子的結(jié)合從而促進(jìn)ISGs的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NOS1通過亞硝基化HDAC2抑制其功能從而抑制了黑色素瘤干擾素反應(yīng)性并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,本課題為靶向NO/NOS1治療腫瘤提供了線索和理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

ＨＤＡＣ８主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，并在平滑肌分化的細(xì)胞中表達(dá)｜３４１。Ｉ類ＨＤＡＣ的逡逑蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征在于高度保守的脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼為短氨基和羧基末逡逑端延伸（圖１）。Ｉ類ＨＤＡＣ作為多蛋白復(fù)合物的一部分被募集并靶向基因以介逡逑導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制，ＨＤＡＣ１和ＨＤＡＣ２是Ｓｉｎ３，Ｍｉ－２／ＮｕｒＤ和ＣｏＲＥＳＴ復(fù)合物的催化逡逑亞基，而ＨＤＡＣ３主要由Ｎ－ＣｏＲ／ＳＭＲＴ復(fù)合物募集，到目前為止，ＨＤＡＣ８尚未逡逑被報(bào)道為任何蛋白質(zhì)復(fù)合物的成員［３５１。逡逑與Ｉ類ＨＤＡＣ不同，Ｉｌａ類ＨＤＡＣ以組織特異性方式表達(dá)，并參與分化和發(fā)逡逑育過程，它們在骨骼，平滑肌，免疫系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)和大腦中發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制逡逑功能。Ｉｌａ類ＨＤＡＣ的一個(gè)特點(diǎn)是具有較長的調(diào)節(jié)性Ｎ－末端結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)與組織逡逑特異性轉(zhuǎn)錄因子和共抑制因子的相互作用氨基末端結(jié)構(gòu)域含有高度保守的逡逑絲氨酸殘基，可以被磷酸化修飾。Ｉｌａ類ＨＤＡＣｓ的信號依賴性磷酸化，是決定它逡逑們是否位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的關(guān)鍵因素，因此，它們在核區(qū)室中作為轉(zhuǎn)錄共抑逡逑制因子存在。盡管Ｉｌａ類ＨＤＡＣ具有高度保守的組蛋白脫乙�；附Y(jié)構(gòu)域

提取總的ＲＮＡ。利用ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)，我們檢測了黑色素瘤Ａ３７５細(xì)胞中ＩＦＮａ誘逡逑導(dǎo)的邋１０邋個(gè)邋ＩＳＧｓ邋（ＩＲＦ７，ＩＳＧ１５，ＩＳＧ５４，ＩＳＧ５６，ＳＯＣＳｌ，ＩＦＩ２７，ＩＦＩＴＭ３，ＯＡＳ３，ＭＸｌ，逡逑ＩＲＦ３）的ｍＲＮＡ表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖１－３Ａ，邋Ｂ），與加了干擾素卻未加抑制逡逑劑的對照組相比，加入ＮＯＳｓ抑制劑（Ｌ－ＮＡＭＥ或Ｎ－ＰＬＡ）均可增加ＩＦＮａ誘導(dǎo)逡逑的ＩＳＧｓ表達(dá)。其中，ＮＯＳ泛抑制劑Ｌ－ＮＡＭＥ處理細(xì)胞后能誘導(dǎo)８個(gè)ＩＳＧｓ表達(dá)逡逑升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ值見表１－６Ａ），邋ＳＯＣＳ１，ＯＡＳ３升高不明顯；而ＮＯＳ１逡逑特異性抑制劑Ｎ－ＰＬＡ作用細(xì)胞后能誘導(dǎo)ＩＳＧｓ表達(dá)增加１－２倍，７個(gè)ＩＳＧｓ表達(dá)逡逑均升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表１－６Ｂ），邋ＩＦＩ２７，邋ＩＦＩＴＭ３，邋ＩＲＦ３升高不明顯，沒有逡逑統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示黑色素瘤Ａ３７５細(xì)胞中的內(nèi)源性ＮＯ參與抑制了邋ＩＦＮａ誘導(dǎo)逡逑的ＩＳＧｓ的表達(dá)，并且三個(gè)ＮＯＳｓ亞型可能均參與了腫瘤細(xì)胞ＩＦＮａ的反應(yīng)性的逡逑調(diào)控，因?yàn)椋危校蹋梁停蹋危粒停艑Γ桑樱牵蟊磉_(dá)調(diào)控的程度相當(dāng)，我們考慮其中逡逑ＮＯＳ１可能是參與調(diào)控ＩＳＧｓ表達(dá)的主要亞型

組和過表達(dá)ＮＯＳｌ邋（ｏｖｅｒ－ＮＯＳｌ）的Ａ３７５，邋ＳＷ４８０，邋ＳＫ０Ｖ３細(xì)胞中加入或不加ＩＦＮａ逡逑處理６小時(shí)，１２小時(shí)，提取細(xì)胞總ＲＮＡ后用ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測了邋１０個(gè)ＩＳＧｓ的逡逑表達(dá)。結(jié)果顯示（圖１－６），與未加干擾素刺激的對照組細(xì)胞相比，加了干擾素處逡逑理的三株腫瘤細(xì)胞中，ＩＳＧｓ的誘導(dǎo)表達(dá)水平差異明顯。其中ＳＫＯＶ３細(xì)胞對干擾逡逑素刺激最為敏感，ＩＦＮａ作用細(xì)胞后可以誘導(dǎo)ＩＳＧｓ表達(dá)升高１－１５０倍，其中ＩＳＧ１５，逡逑ＩＳＧ５４，邋ＩＳＧ５６，邋ＩＦＩ２７，邋ＭＸ１邋升高最為明顯，ＩＳＧ１５，邋ＩＳＧ５４，邋ＩＳＧ５６邋在邋６邋小時(shí)刺逡逑激時(shí)表達(dá)水平較高，１２小時(shí)后有所降低，而ＩＦＩ２７，邋ＭＸ１在６小時(shí)刺激時(shí)表達(dá)逡逑相對較低，１２小時(shí)刺激時(shí)表達(dá)較高，表明不同基因反應(yīng)時(shí)間存在不一致性。但逡逑與ＳＫＯＶ３細(xì)胞相比，Ａ３７５細(xì)胞和ＳＷ４８０細(xì)胞對干擾素刺激不敏感，ＩＦＮａ作逡逑用細(xì)胞后僅能誘導(dǎo)ＩＳＧｓ表達(dá)增加１到５倍，表明這三株腫瘤細(xì)胞對ＩＦＮａ反應(yīng)逡逑性不同。在這三株腫瘤細(xì)胞中

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1 羅振革,高杰英,李紅,彭虹,朱錫華;CD44單克隆抗體對人黑色素瘤細(xì)胞的體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1996年05期

2 王結(jié)義;王龍生;宋家g

本文編號：2818598