目的:惡性黑色素瘤最常見的遺傳學(xué)改變是BRAF V600E突變,針對該突變開發(fā)出的BRAF抑制劑維羅非尼是治療惡性黑色素瘤的一線藥物,但是該藥在臨床治療過程中普遍產(chǎn)生耐藥性,其機制尚未完全闡明。為探索該耐藥機制,我們擬構(gòu)建覆蓋全基因組的短鏈非編碼RNA(50堿基)文庫,運用該RNA文庫快速篩選獲得維羅非尼耐藥黑色素瘤細胞,并通過利用該耐藥細胞模型及高通量測序等手段探索黑色素瘤耐藥新機制,為尋求新的治療靶點提供理論依據(jù)。方法:以逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架pSEB-61d質(zhì)粒為載體,利用RNA聚合酶III依賴的U6啟動子精確控制系統(tǒng),通過化學(xué)法合成50堿基隨機排列的引物,利用該引物PCR擴增含50堿基隨機排列的雙鏈DNA作為Gibson Assembly的插入片段,將該PCR產(chǎn)物片段在U6啟動子下方通過Gibson Assembly方法構(gòu)建short regulatory RNA(srRNA)文庫,命名為pSEB-U50文庫,并對該方法進行文庫構(gòu)建克隆陽性率、覆蓋率等方面的鑒定。將pSEB-U50文庫質(zhì)粒包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒、感染伴有BRAF V600E突變的黑色素瘤細胞A375,Mel-888,再通過致死劑量的維羅非尼篩選建立耐藥黑色素瘤細胞模型。提取文庫篩選耐藥細胞基因組DNA,特異性擴增出包含50堿基的片段用于Illumina HiSeq平臺測序,試圖找到耐藥細胞富集的50堿基片段,并利用qPCR檢測耐藥細胞中耐藥相關(guān)基因的表達。為探討pSEB-U50文庫篩選出的耐藥細胞自噬發(fā)生的變化情況,設(shè)計并構(gòu)建了自噬流監(jiān)測腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3,成功應(yīng)用于耐藥細胞的自噬流的監(jiān)測,同時應(yīng)用了其他細胞模型和動物實驗對該腺病毒的體內(nèi)外自噬流的監(jiān)測進行評價。結(jié)果:(1)應(yīng)用Gibson Assembly構(gòu)建pSEB-U50文庫具有高效性,一次組裝文庫質(zhì)粒數(shù)約為2.5×10~6,并且由于在載體質(zhì)粒中引入了細菌自殺基因ccdB,成功地提高了文庫構(gòu)建時克隆陽性率,達到95%以上。將隨機挑選的20個陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒提取后進行測序,發(fā)現(xiàn)文庫質(zhì)粒中插入的50堿基片段沒有重復(fù),說明該文庫具有多樣性及高覆蓋率。(2)在2%濃度血清培養(yǎng)條件下,維羅非尼作用于A375的致死劑量為10uM;Mel-888的致死劑量為15uM。(3)感染逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-U50短鏈非編碼RNA文庫的A375、Mel-888細胞,使用致死劑量的維羅非尼進行耐藥篩選,結(jié)晶紫染色結(jié)果表明,感染了pSEB-U50短鏈非編碼RNA文庫的A375,Mel-888細胞在高達30uM的藥物濃度情況下可以存活,證實成功篩選出了文庫作用后的耐藥黑色素瘤細胞。(4)流式細胞周期結(jié)果顯示:與親代細胞相比,A375U50V細胞對維羅非尼有較好的細胞耐受能力。在維羅非尼作用下,A375U50V細胞S期+G2期細胞比例從(7.11%+30.24%)37.35%變化至(8.47%+28.04%)36.51%,而親代細胞的S期+G2期細胞比例由(7.08+18.62%)25.7%下降到(0.68%+0.95%)1.63%,說明在5uM維羅非尼作用下,親代細胞的增殖已明細抑制,而耐藥A375U50V細胞周期未受影響。(5)使用Tq-PCR檢測A375親代細胞及文庫篩選的耐藥細胞A375-U50V,及其它們在低濃度維羅非尼作用下的細胞中耐藥相關(guān)基因的表達,發(fā)現(xiàn)耐藥細胞A375-U50V在低濃度維羅非尼作用24h后,多重耐藥基因、EMT相關(guān)基因、腫瘤干性相關(guān)基因、細胞自噬相關(guān)基因表達顯著升高。(6)成功構(gòu)建了腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3,應(yīng)用于A375親代及A375-U50V自噬的檢測,發(fā)現(xiàn)耐藥細胞中自噬活性增加,與自噬基因表達增加相一致;并且腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3應(yīng)用于其它細胞及體內(nèi)實驗證實:該病毒可成功監(jiān)測自噬流中自噬小體形成、自噬小體與溶酶體融合,表現(xiàn)為觀察到細胞漿中綠色顆粒消失,紅色顆粒不變的情況。結(jié)論:本研究以BRAF V600E突變細胞A375、Mel-888為細胞模型,通過導(dǎo)入自建的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSEB-U50短鏈非編碼RNA文庫、致死劑量維羅非尼藥物快速篩選、結(jié)晶紫染色、流式細胞術(shù)及q-PCR等實驗,成功得到文庫篩選后的耐藥黑色素瘤細胞,并且發(fā)現(xiàn)該耐藥機制可能與細胞自噬增加、EMT及腫瘤干性等相關(guān);另外,成功構(gòu)建了自噬監(jiān)測腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3及體內(nèi)外實驗成功得到應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

在 5’核酸外切酶、T4 DNA 連接酶和 DNA 合成酶作用下（作用過程參見圖1.1）， 50 ℃水浴 15～60 分鐘，隨后將產(chǎn)物用于進行細菌轉(zhuǎn)化，整個定向克隆過程完成。該方法具有如下優(yōu)點：（1）簡單、快速和高效；（2）幾乎可以向任何載體在任何位點（具有酶切位點可以用于線性化質(zhì)粒）進行定向克�。唬�3）不需要考慮插入片段本身具有的酶切位點的影響；（4）可用于多片段，最高達 15 個片段的同時連接，片段長度可達 100bp～10kb。經(jīng)典的 DNA 定向克隆方法主要是使用限制性內(nèi)切酶酶切、T4 DNA 連接酶連接來進行，但該方法存在一些缺點，主要包括：受連接片段內(nèi)酶切位點限制、多片段連接時需要對每個片段單獨進行處理，操作步驟增多等， 而采用 Gibsonassembly 方法可以克服這些缺點。因此，我們選擇 Gibson assembly 方法來構(gòu)建隨機短鏈非編碼 RNA 文庫。本課題以逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒 pSEB-61d 為載體（見圖 1.2）， 在 U6 啟動子下方某段位置以化學(xué)法合成隨機 50 個堿基的 小 RNA 片段

圖 1.1 來自于 NEB 公司的 Gibson Assembly 原理示意圖Figure1.1 Gibson assembly overview from NEB

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文on Assembly 隨機短鏈非編碼 RNA 文庫質(zhì)粒菌落計數(shù)一次組裝的文庫質(zhì)粒 100ul,取 10ul 電轉(zhuǎn)化入 DH10B 感受態(tài)細 500ul LB 稀釋，取 5ul 用于 Amp LB 涂板，在細菌培養(yǎng)箱中 落長到一定大小后，進行菌落計數(shù)及拍照。如圖 1.3 所示，該500 個，因為是稀釋 1000 后所得菌落數(shù)，那么一次 Gibson Ass數(shù)目大約為：2500×1000=2.5×106。本文庫構(gòu)建時共重復(fù)進行embly,因此本文庫所含的菌落數(shù)大約為 3.25×107。該文庫的菌n Assembly 次數(shù)增加可繼續(xù)增加。（圖 1.3）。1:1000 稀 釋

【參考文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王靜;應(yīng)用全基因組siRNA文庫篩選黑色素瘤耐藥細胞株及其機制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號：2818566