目的 應(yīng)用體外培養(yǎng)人正常皮膚(normal skin, NS)及瘢痕疙瘩(keloid)成纖維細(xì)胞模型,觀察MEK/ERK信號(hào)通路特異性抑制劑5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU,PD98059)對兩組細(xì)胞的增殖、凋亡及部分生物學(xué)功能的影響,以及5-FU作用后細(xì)胞內(nèi)MEK/ERK信號(hào)通路中多個(gè)相關(guān)信號(hào)蛋白分子活化的變化情況,探討5-FU對正常皮膚及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用,以及MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在瘢痕疙瘩形成中的作用機(jī)制,為瘢痕疙瘩形成的機(jī)制研究以及臨床應(yīng)用5-FU治療瘢痕疙瘩提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 收集人體的正常皮膚以及瘢痕疙瘩組織,應(yīng)用組織塊法分離原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblast,KFB)及正常皮膚成纖維細(xì)胞(normal skin fibroblast,NSFB),進(jìn)行成纖維細(xì)胞鑒定及繪制生長曲線；各組細(xì)胞經(jīng)濃度分別為(0.1g/L,0.25g/L,0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L)的5-FU作用48h后,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測細(xì)胞增殖及成纖維細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50值)；選用3個(gè)5-FU濃度分別為(0.25g/L,0.5g/L,1.0g/L),做為以下實(shí)驗(yàn)的濃度；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；Western Blot法檢測5-FU作用后MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號(hào)蛋白分子MEK1、MEK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果 1.5例手術(shù)切取的瘢痕疙瘩和2例正常皮膚標(biāo)本組織,原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞全部成活,細(xì)胞生長良好,融合成片,形態(tài)正常。 2.倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞的形態(tài),呈梭形、長條形,少數(shù)多角形或不規(guī)則形,1-2天即呈融合狀態(tài)。成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色,顯示成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒,核為藍(lán)色。 3.通過生長曲線比較,第1-2天兩組細(xì)胞為滯留期；第3-6天為對數(shù)生長期；第6天以后,為平臺(tái)期。在相同生長環(huán)境下,瘢痕疙瘩培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞同正常皮膚相比,其增殖速度較快。 4.MTT檢測,各組細(xì)胞經(jīng)濃度分別為(0.1g/L,0.25g/L0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L)的5-FU作用48h后,隨著藥物濃度的升高OD值逐漸降低,各組細(xì)胞的增殖均受到抑制(P0.05),表明藥物對細(xì)胞的作用存在劑量—效應(yīng)關(guān)系。各組成纖維細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50值)分別為正常皮膚組(1.237士0.041)g/L,瘢痕疙瘩組(0.530士0.032)g/L。 5.各組成纖維細(xì)胞經(jīng)不同濃度5-FU作用48小時(shí)后,隨藥物濃度的增加,KFB與對照組相比G0-G1細(xì)胞比例逐漸下降,S期細(xì)胞數(shù)量比例增加,G2-M細(xì)胞數(shù)量增加(P0.05)；而NSFB與對照組相比G0-G1細(xì)胞比例逐漸下降(P0.05)。表明細(xì)胞大部分被阻滯在G1期,細(xì)胞分裂受到抑制。 6.兩組細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見TUNEL陽性信號(hào)為強(qiáng)綠色熒光,位于胞核內(nèi),呈小圓形、環(huán)行或小顆粒聚集狀。對照組成纖維細(xì)胞可見少量凋亡細(xì)胞,而各實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞數(shù)量隨藥物濃度的提高而上升,與對照相比具有非常顯著性差異(P0.01)。 7.經(jīng)不同濃度5-FU作用48小時(shí)后,兩組細(xì)胞的MEK1及MEK1/2蛋白表達(dá)均低于對照組,且隨藥物濃度的提高而降低(P0.05)。 結(jié)論 5-FU能有效的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,該藥物具有明顯的抗瘢痕作用；5-FU可能通過干擾MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,發(fā)揮抗瘢痕作用。MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在瘢痕疙瘩的形成中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R751.05

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 武曉莉;劉偉;曹誼林;;低濃度5-氟尿嘧啶抑制血管增生在瘢痕疙瘩綜合治療中的作用初探[J];中華整形外科雜志;2006年01期

本文編號(hào)：2818526