發(fā)布時間：2020-09-14 18:41

　　 目的 應用體外培養(yǎng)人正常皮膚(normal skin, NS)及瘢痕疙瘩(keloid)成纖維細胞模型,觀察MEK/ERK信號通路特異性抑制劑5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU,PD98059)對兩組細胞的增殖、凋亡及部分生物學功能的影響,以及5-FU作用后細胞內MEK/ERK信號通路中多個相關信號蛋白分子活化的變化情況,探討5-FU對正常皮膚及瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物學作用,以及MEK/ERK信號轉導途徑在瘢痕疙瘩形成中的作用機制,為瘢痕疙瘩形成的機制研究以及臨床應用5-FU治療瘢痕疙瘩提供實驗依據。 方法 收集人體的正常皮膚以及瘢痕疙瘩組織,應用組織塊法分離原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblast,KFB)及正常皮膚成纖維細胞(normal skin fibroblast,NSFB),進行成纖維細胞鑒定及繪制生長曲線；各組細胞經濃度分別為(0.1g/L,0.25g/L,0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L)的5-FU作用48h后,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測細胞增殖及成纖維細胞半數抑制濃度(IC50值)；選用3個5-FU濃度分別為(0.25g/L,0.5g/L,1.0g/L),做為以下實驗的濃度；流式細胞術檢測細胞周期；TUNEL法檢測細胞凋亡；Western Blot法檢測5-FU作用后MEK/ERK信號轉導通路中信號蛋白分子MEK1、MEK1/2磷酸化蛋白的表達變化。 結果 1.5例手術切取的瘢痕疙瘩和2例正常皮膚標本組織,原代培養(yǎng)成纖維細胞全部成活,細胞生長良好,融合成片,形態(tài)正常。 2.倒置顯微鏡下觀察成纖維細胞的形態(tài),呈梭形、長條形,少數多角形或不規(guī)則形,1-2天即呈融合狀態(tài)。成纖維細胞波形蛋白免疫細胞化學染色,顯示成纖維細胞胞漿內見大量棕黃色顆粒,核為藍色。 3.通過生長曲線比較,第1-2天兩組細胞為滯留期；第3-6天為對數生長期；第6天以后,為平臺期。在相同生長環(huán)境下,瘢痕疙瘩培養(yǎng)出的成纖維細胞同正常皮膚相比,其增殖速度較快。 4.MTT檢測,各組細胞經濃度分別為(0.1g/L,0.25g/L0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L)的5-FU作用48h后,隨著藥物濃度的升高OD值逐漸降低,各組細胞的增殖均受到抑制(P0.05),表明藥物對細胞的作用存在劑量—效應關系。各組成纖維細胞半數抑制濃度(IC50值)分別為正常皮膚組(1.237士0.041)g/L,瘢痕疙瘩組(0.530士0.032)g/L。 5.各組成纖維細胞經不同濃度5-FU作用48小時后,隨藥物濃度的增加,KFB與對照組相比G0-G1細胞比例逐漸下降,S期細胞數量比例增加,G2-M細胞數量增加(P0.05)；而NSFB與對照組相比G0-G1細胞比例逐漸下降(P0.05)。表明細胞大部分被阻滯在G1期,細胞分裂受到抑制。 6.兩組細胞在熒光顯微鏡下可見TUNEL陽性信號為強綠色熒光,位于胞核內,呈小圓形、環(huán)行或小顆粒聚集狀。對照組成纖維細胞可見少量凋亡細胞,而各實驗組的凋亡細胞數量隨藥物濃度的提高而上升,與對照相比具有非常顯著性差異(P0.01)。 7.經不同濃度5-FU作用48小時后,兩組細胞的MEK1及MEK1/2蛋白表達均低于對照組,且隨藥物濃度的提高而降低(P0.05)。 結論 5-FU能有效的誘導成纖維細胞細胞凋亡,抑制細胞增殖,該藥物具有明顯的抗瘢痕作用；5-FU可能通過干擾MEK/ERK信號轉導途徑,發(fā)揮抗瘢痕作用。MEK/ERK信號轉導途徑在瘢痕疙瘩的形成中發(fā)揮重要作用。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R751.05

【參考文獻】

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1 武曉莉;劉偉;曹誼林;;低濃度5-氟尿嘧啶抑制血管增生在瘢痕疙瘩綜合治療中的作用初探[J];中華整形外科雜志;2006年01期

本文編號：2818526