目的:為研究以hIL-24基因構建的原核表達載體pET-21a(+)/ hIL-24在大腸桿菌中表達及其部分純化、復性得到的蛋白產物——重組人白介素24(rhIL-24)對A375黑色素瘤細胞體內外的抗腫瘤效應及其分子機理。 方法:以原核表達載體pBV220-hIL-24為模板構建新的pET-21a(+)/hIL-24重組原核表達載體系統,并在大腸桿菌中獲得高效表達,將表達產物純化、復性后得到初步純化的rhIL-24,經Western-blot方法鑒定后,用rhIL-24刺激PBMC,收集細胞培養(yǎng)液上清,用ELISA方法檢測PBMC分泌的IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。用rhIL-24作用于體外培養(yǎng)的人A375黑色素瘤細胞,用MTT法去評價rhIL-24對A375細胞生長的影響,繪制出細胞生長曲線;通過流式細胞術(FCM),熒光染色等檢測rhIL-24對A375細胞生長周期和凋亡的影響。用rhIL-24作用于雞胚尿囊膜(CAM),觀察其對血管新生的影響。在裸鼠真皮下建立人A375細胞黑色素瘤動物模型后,用rhIL-24治療,測量瘤體的體積及重量以檢測rhIL-24等對瘤體生長的抑制作用。用免疫組化檢測腫瘤組織中的BAX、BCL-2、CD34及VEGF的表達情況,以確認經rhIL-24治療后腫瘤細胞生長是否受到抑制及腫瘤組織血管新生是否減少。 結果:經PCR及酶切產物電泳證實所克隆的基因長度與理論值接近,經序列測定證實所克隆的基因與GenBank報道的hIL-24序列完全一致,為474bp。構建的原核表達載體pET-21a(+)/ hIL-24,經雙酶切和PCR鑒定,原核表達載體構建正確。pET-21a(+)/ hIL-24轉染的BL21宿主菌誘導表達后裂解菌體、提取包涵體的內容物,再進行SDS-PAGE電泳,有一條18.5KD左右的蛋白條帶出現,與理論值一致。Western-blot檢測該產物能與IL-24抗體形成特異性條帶。含pET-21a(+)/ hIL-24的宿主菌BL21經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后,rhIL-24在大腸桿菌中獲高效表達。初步純化的rhIL-24能刺激PBMC增加IL-6、IFN-γ及TNF-α的分泌, 72
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：2813250