【摘要】：白發(fā)作為臨床常見的一種毛發(fā)色素障礙性疾病,雖不會引起嚴重軀體疾病,但對患者的自信心和社會認同度有極大影響,可嚴重影響患者的生活質量。隨著人們生活節(jié)奏的加快和生活壓力的增加,白發(fā)患者的發(fā)病年齡不但呈現(xiàn)出低齡化趨勢,其發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢。伴隨著人們生活水平和對自我形象要求的提高,越來越多的患者開始尋求白發(fā)變黑發(fā)的治療方法。臨床中最為常見的白發(fā)類型是老年性白發(fā)和過早性頭,患者目前主要通過染發(fā)劑上色來改變頭發(fā)顏色,該法不但存在著損傷發(fā)質、易于過敏、致癌和部分人群不適用的弊端,其療效也十分有限。眾所周知,人體內毛發(fā)的顏色取決于毛囊中黑素細胞所分泌的黑素顆粒數量和類型。毛球部的黑素細胞如出現(xiàn)數量減少或功能障礙�？梢鸷谒仡w粒數量的減少,從而導致白發(fā)的發(fā)生。毛囊無黑素黑素細胞存在于毛囊外根鞘部位,對毛發(fā)著色過程有著重要影響。在胚胎發(fā)育過程中,成黑素細胞從神經上皮遷出,經過一系列周期性的遷移和增殖,最終定位在表皮和毛囊當中。在鼠孕期的10.5-13.5天,成黑素細胞遷移至表皮,孕14.5天遷入發(fā)育的毛囊,出生后僅位于毛囊中。胚胎期毛囊中的成黑素細胞分化成兩個族群：一類是位于毛基質中的成熟黑素細胞(PDMC),另一類是位于毛囊隆突區(qū)的黑素干細胞(McSC)。在成年人的毛發(fā)周期中,隆突部位的McSC可在外界信號的刺激下向下遷移至毛囊外根鞘并分化成無黑素黑素細胞(AMMC)；隨后,AMMC在外界信號的刺激下進一步向下遷移至毛球部并分化成成熟黑素細胞。其中McSC僅表達Dct+、Pax3+、Sox10、AMMC是一種低分化狀態(tài)的黑素細胞,具有較低的黑素顆粒合成能力,無著色功能,不與酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白Ⅰ、Ⅱ受體抗體反應；PDMC是一中Dct+、Kit+、Mitf、 Pax3+、Sox10+.tyr+、TRP-1+、TRP-2+、Mclr+的成熟黑素細胞,具有較強黑素顆粒的合成能力,主要負責毛發(fā)的著色。AMMC具有細胞體積小、多呈雙極性的特點,黑素合成能力較低,在體外培養(yǎng)具有增殖和分化成為PDMC的能力。PDMC具有細胞體積大、呈樹突狀外形的特點,處于高分化狀態(tài),在體外培養(yǎng)過程中無增殖分化能力,但具有合成黑素顆粒的能力。黑素細胞中,負責黑素合成分泌的特殊細胞器稱為黑素小體。根據其特性,黑素小體有四個分型：Ⅰ型為多泡核內體,以含有豐富雙層平面網格蛋白為特征；Ⅱ型的典型特征是形成特定排序加工的有條紋狀黑素小體前體；Ⅲ型黑素小體開始合成黑素,內部有明顯可見的光條紋；Ⅳ型是成熟的完全著色的黑素小體,聚積在細胞樹突中。AMMC中含有豐富的Ⅰ期、Ⅱ期黑素小體,偶爾可觀察到Ⅲ期黑素小體,不含有Ⅳ期黑素小體,PDMC中含有Ⅰ～Ⅳ型黑素小體。毛發(fā)著色和表皮著色的最大區(qū)別在于：毛發(fā)著色是隨著毛發(fā)生長周期變化的更替過程,而表皮著色是一個連續(xù)發(fā)生的過程。毛發(fā)著色的過程主要發(fā)生在毛發(fā)生長期的初期,此時黑素干細胞增殖分化成兩種黑素細胞類型：定位于外毛根鞘的AMMC和定位于毛球部的PDMC。在毛發(fā)生長期的Ⅲ/Ⅳ期,毛球部的PDMC大量聚集,黑素大量合成,毛干著色發(fā)生。這一著色過程持續(xù)到生長期Ⅴ/Ⅵ期,停止于退行期早期。在退行期Ⅱ期毛球部PDMC發(fā)生凋亡,持續(xù)到退行期Ⅶ期凋亡殆盡,能觀察到黑素碎片。健康人毛發(fā)著色一直重復這一過程,在大約第十個毛發(fā)生長周期(40歲左右)這一個過程發(fā)生變化,毛球部黑素細胞數量減少、活性減弱,不能維持長時間的生長期毛發(fā)著色,因而逐漸產生白發(fā)[l1]。毛發(fā)著色過程如下：在毛囊生長期初期,黑素細胞能夠合成黑素,通過樹突狀突起將黑素轉運至鄰近的毛干皮質和髓質。進入退行期后,黑素細胞發(fā)生老化甚至凋亡,黑素合成停止,樹突亦逐漸消失。上皮、間質和神經外胚層相互作用,共同調控著毛囊黑素細胞的代謝和毛干的著色。在黑素轉運過程中,黑素細胞的樹突起吞噬、聚集黑素小體并通過吞泡吐泡作用將其轉運至鄰近上皮細胞的作用。這些上皮細胞與黑素細胞一樣能夠吞噬、聚集黑素小體,區(qū)別在于這些上皮細胞并不發(fā)生退化。影響誘發(fā)白發(fā)的因素多種多樣,比如：干細胞龕微環(huán)境的改變,活性氧及機體內神經內分泌因子水平的變化均可誘導產生白發(fā)。然而,在白發(fā)發(fā)生過程中AMMCs比毛囊中任何類型的黑素細胞都要不敏感,受到更多保護,存活時間更長。因此,無黑素黑素細胞是研究毛發(fā)著色及白發(fā)復色治療最好的細胞模型。本課題的研究主要包括以下兩個方面：1,比較FIUE結合酶消化方法與幾種不同的無黑素黑素細胞的體外培養(yǎng)方法由于毛囊是易于獲取的組織,并含有近12%的干細胞,在再生醫(yī)學中,毛囊為自體細胞療法治療燒傷患者、白癜風的復色治療、或促進慢性潰瘍的愈合甚至神經再生有著重要作用[14-211。毛囊的黑素細胞分為兩種類型：分布在漏斗部和毛球部的色素化樹突狀黑素細胞(PDMC),及存在毛囊中下部外毛根鞘的無黑素黑素細胞(ANMC)。 PDMC已高度分化,增殖能力有限,外毛根鞘來源的AMMC分化程度低,增殖潛力大。因此,AMMC的體外培養(yǎng)模型可以作為研究白發(fā)、白癜風等色素障礙性疾病的發(fā)病機制的基礎,也可以用來篩選治療這些疾病的藥物和方法。[目的]比較不同的無黑素黑素細胞的體外培養(yǎng)方法。[方法]采用FUE毛囊鉆取技術,加上優(yōu)化的酶消化方法,配以sincecell黑素細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)獲取無黑素黑素細胞。實驗分為三組,每一組五個培養(yǎng)樣本,每個培養(yǎng)皿放置30個分離消化毛囊進行培養(yǎng)。實驗分為三步：第一步,單純酶消化步驟過程復雜,為了優(yōu)化便捷獲取單位毛囊過程,結合FUE毛囊鉆取技術,講酶消化步奏從三步簡化至一步,大大縮短酶消化時間。第二步,在優(yōu)化的單位毛囊獲取方法的基礎上,摸索最適宜的酶消化時間,縮短細胞遷出時間并提高細胞遷出率。第三步,對比直接拔取法、酶消化法及FUE+酶消化法：同一批次的毛囊,使用三種不同方式獲取,放置在一樣的培養(yǎng)條件下,比較得出FUE+酶消化法培養(yǎng)的毛囊細胞遷出率要高于直接拔取法及單純酶消化法,且細胞遷出時間更短。將培養(yǎng)出的細胞通過免疫熒光和透射電鏡的方法進行鑒定。[結果]l,FUE+酶消化法的細胞遷出時間明顯短于直接拔取培養(yǎng)法及傳統(tǒng)酶消化法,且細胞遷出率明顯增加。2,配以FUE及酶消化的培養(yǎng)方式,可以簡化沒消化步驟,可以節(jié)省近一半的酶消化時間及經濟成本。3,FUE鉆取的毛囊最佳消化時間在30min左右。結合FUE結合Ⅳ型膠原酶酶消化30min的方式,外毛根鞘細胞在3-5天開始遷出,10天左右遷出達到高峰。細胞培養(yǎng)周期由原來普遍認為的4周,縮短至不到3周。因此,本實驗的優(yōu)化培養(yǎng)方式能夠更快的更便捷的獲得無黑素黑素細胞。是是S100B、NKI/beteb免疫熒光鑒定結果為陽性,透射電鏡觀察結果可觀察到黑素小體。[結論]FUE可以節(jié)省顯微分離單位毛囊的時間,提高顯微分離的效率,并且簡化了酶消化的步驟。較之顯微分離的物理損傷、長時間暴露損傷,及單純酶消化的多重酶消化時間過長對獲取的毛囊的損傷更小,活性更強。2,觀察無黑素黑素細胞體外培養(yǎng)過程的形態(tài)變化,及低氧干預對無黑素黑素細胞的影響。毛囊中黑素細胞家族主要分為三類：一是存在毛囊隆突區(qū)域的黑素干細胞,此類細胞具有分化能力,作為毛發(fā)生長周期中黑素細胞的補給來源；二是位于外毛根鞘的AMMC,具有細胞體積小、細長且多呈雙極性的特點,黑素合成能力低,在體外培養(yǎng)具有很強的增殖能力；再是位于毛球部的PDMC,包饒這毛乳頭,混雜在毛母質當中,具有細胞體積大、胞體呈樹突狀多極性的特點,處于高分化狀態(tài),在體外培養(yǎng)過程中幾乎無增殖分化能力,但具有合成黑素顆粒的能力。[目的]觀察無黑素黑素細胞在體外培養(yǎng)過程中形態(tài)變化及探尋低氧培養(yǎng)對黑素細胞的作用。[方法]采用FUE+酶消化培養(yǎng)出的無黑素黑素細胞,進行傳代培養(yǎng)。實驗分為兩大部分：第一,記錄0、1、3、5、7代細胞的形態(tài)變化過程,拍攝并記錄。將形態(tài)發(fā)生變化的細胞做免疫熒光染色,鑒定其細胞特性的改變。第二,將同一批次的第3代無黑素黑素細胞做劃痕處理分為兩部分,一部分放入含5%氧含量的低氧培養(yǎng)箱。觀察兩部分細胞,劃痕實驗的一個變化,分0、6、12、24小時觀察細胞變化,取樣并拍照,根據劃痕恢復時間差別比較兩種條件下細胞增殖及遷移能力的不同。同時在兩種培養(yǎng)箱中,傳代培養(yǎng)細胞,比較兩批細胞的一個形態(tài)變化有無差別,觀察不同培養(yǎng)環(huán)境對細胞形態(tài)及特性的維持作用。[結果]1,無黑素黑素細胞在培養(yǎng)過程中,細胞形態(tài)由雙極性向樹突型變化,第6代細胞開始,兩種細胞類型的主導地位發(fā)生顛覆,將第6、9代,進行HMB45抗體免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)陽性結果的細胞。而無黑素黑素細胞作為黑素細胞前體,在原代培養(yǎng)獲得時HMB45抗體的染色是陰性的。HMB45抗體陽性表達在黑色素瘤及成熟黑素細胞中。說明無黑素黑素細胞在培養(yǎng)過程中是在逐漸成熟和分化的。2,在低氧細胞培養(yǎng)箱中,細胞劃痕實驗的恢復時間明顯短于普通細胞培養(yǎng)箱的細胞,且無黑素黑素細胞形態(tài)基本不發(fā)生形態(tài)變化。[結論]無黑素黑素細胞在體外培養(yǎng)過程中,會進行分化、成熟,從不具備著色能力的黑素細胞前體,演化為成熟黑素細胞,也許這正是其作為黑素細胞庫的來源的原因。低氧培養(yǎng)環(huán)境給予了無黑素黑素細胞一個更好的擬生態(tài)環(huán)境,更好的維持了細胞特性及其活性。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R758.71
【圖文】：

圖２；圖Ａ為消化１５ｍｉｎ時，毛囊培養(yǎng)７天時情況，并不能見細胞遷出。WＢ為消化３０ｍｉｎ逡逑時，毛囊培養(yǎng)７天，可見毛囊外毛根挿周圍有大量半透明細胞遷出，迂出范圍較大。圖Ｃ逡逑為消化６０ｍｉｎ時，毛囊培養(yǎng)７天，ｎｊ見毛囊外毛根挿周圍有細胞遷出，但較３0ｍｉｎ時細胞逡逑要少。圖Ｄ為消化９０ｍｍ時，毛囊培養(yǎng)７天，幾乎不能見細胞遷出。（１００Ｘ）逡逑１４逡逑

ＡＢ圖１１，Ａ、Ｂ兩圖分別在低氧環(huán)境在下及常氧環(huán)境下Ｐ７ＡＭＭＣ的細胞形態(tài)。Ａ圖為低氧逡逑環(huán)境，細胞依然呈雙極性，細長梭形細胞。Ｂ圖為常氧環(huán)境下，細胞呈樹突化。逡逑３．討論逡逑人類毛囊黑素細胞分為兩個亞型，一類位于生長期毛囊毛球部具有黑素合成逡逑

圖２；圖Ａ為消化１５ｍｉｎ時，毛囊培養(yǎng)７天時情況，并不能見細胞遷出。WＢ為消化３０ｍｉｎ逡逑時，毛囊培養(yǎng)７天，可見毛囊外毛根挿周圍有大量半透明細胞遷出，迂出范圍較大。圖Ｃ逡逑為消化６０ｍｉｎ時，毛囊培養(yǎng)７天，ｎｊ見毛囊外毛根挿周圍有細胞遷出，但較３0ｍｉｎ時細胞逡逑要少。圖Ｄ為消化９０ｍｍ時，毛囊培養(yǎng)７天，幾乎不能見細胞遷出。（１００Ｘ）逡逑１４逡逑

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本文編號：2806655