【摘要】：白發(fā)作為臨床常見(jiàn)的一種毛發(fā)色素障礙性疾病,雖不會(huì)引起嚴(yán)重軀體疾病,但對(duì)患者的自信心和社會(huì)認(rèn)同度有極大影響,可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著人們生活節(jié)奏的加快和生活壓力的增加,白發(fā)患者的發(fā)病年齡不但呈現(xiàn)出低齡化趨勢(shì),其發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。伴隨著人們生活水平和對(duì)自我形象要求的提高,越來(lái)越多的患者開(kāi)始尋求白發(fā)變黑發(fā)的治療方法。臨床中最為常見(jiàn)的白發(fā)類型是老年性白發(fā)和過(guò)早性頭,患者目前主要通過(guò)染發(fā)劑上色來(lái)改變頭發(fā)顏色,該法不但存在著損傷發(fā)質(zhì)、易于過(guò)敏、致癌和部分人群不適用的弊端,其療效也十分有限。眾所周知,人體內(nèi)毛發(fā)的顏色取決于毛囊中黑素細(xì)胞所分泌的黑素顆粒數(shù)量和類型。毛球部的黑素細(xì)胞如出現(xiàn)數(shù)量減少或功能障礙�？梢鸷谒仡w粒數(shù)量的減少,從而導(dǎo)致白發(fā)的發(fā)生。毛囊無(wú)黑素黑素細(xì)胞存在于毛囊外根鞘部位,對(duì)毛發(fā)著色過(guò)程有著重要影響。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,成黑素細(xì)胞從神經(jīng)上皮遷出,經(jīng)過(guò)一系列周期性的遷移和增殖,最終定位在表皮和毛囊當(dāng)中。在鼠孕期的10.5-13.5天,成黑素細(xì)胞遷移至表皮,孕14.5天遷入發(fā)育的毛囊,出生后僅位于毛囊中。胚胎期毛囊中的成黑素細(xì)胞分化成兩個(gè)族群：一類是位于毛基質(zhì)中的成熟黑素細(xì)胞(PDMC),另一類是位于毛囊隆突區(qū)的黑素干細(xì)胞(McSC)。在成年人的毛發(fā)周期中,隆突部位的McSC可在外界信號(hào)的刺激下向下遷移至毛囊外根鞘并分化成無(wú)黑素黑素細(xì)胞(AMMC)；隨后,AMMC在外界信號(hào)的刺激下進(jìn)一步向下遷移至毛球部并分化成成熟黑素細(xì)胞。其中McSC僅表達(dá)Dct+、Pax3+、Sox10、AMMC是一種低分化狀態(tài)的黑素細(xì)胞,具有較低的黑素顆粒合成能力,無(wú)著色功能,不與酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白Ⅰ、Ⅱ受體抗體反應(yīng)；PDMC是一中Dct+、Kit+、Mitf、 Pax3+、Sox10+.tyr+、TRP-1+、TRP-2+、Mclr+的成熟黑素細(xì)胞,具有較強(qiáng)黑素顆粒的合成能力,主要負(fù)責(zé)毛發(fā)的著色。AMMC具有細(xì)胞體積小、多呈雙極性的特點(diǎn),黑素合成能力較低,在體外培養(yǎng)具有增殖和分化成為PDMC的能力。PDMC具有細(xì)胞體積大、呈樹(shù)突狀外形的特點(diǎn),處于高分化狀態(tài),在體外培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)增殖分化能力,但具有合成黑素顆粒的能力。黑素細(xì)胞中,負(fù)責(zé)黑素合成分泌的特殊細(xì)胞器稱為黑素小體。根據(jù)其特性,黑素小體有四個(gè)分型：Ⅰ型為多泡核內(nèi)體,以含有豐富雙層平面網(wǎng)格蛋白為特征；Ⅱ型的典型特征是形成特定排序加工的有條紋狀黑素小體前體；Ⅲ型黑素小體開(kāi)始合成黑素,內(nèi)部有明顯可見(jiàn)的光條紋；Ⅳ型是成熟的完全著色的黑素小體,聚積在細(xì)胞樹(shù)突中。AMMC中含有豐富的Ⅰ期、Ⅱ期黑素小體,偶爾可觀察到Ⅲ期黑素小體,不含有Ⅳ期黑素小體,PDMC中含有Ⅰ～Ⅳ型黑素小體。毛發(fā)著色和表皮著色的最大區(qū)別在于：毛發(fā)著色是隨著毛發(fā)生長(zhǎng)周期變化的更替過(guò)程,而表皮著色是一個(gè)連續(xù)發(fā)生的過(guò)程。毛發(fā)著色的過(guò)程主要發(fā)生在毛發(fā)生長(zhǎng)期的初期,此時(shí)黑素干細(xì)胞增殖分化成兩種黑素細(xì)胞類型：定位于外毛根鞘的AMMC和定位于毛球部的PDMC。在毛發(fā)生長(zhǎng)期的Ⅲ/Ⅳ期,毛球部的PDMC大量聚集,黑素大量合成,毛干著色發(fā)生。這一著色過(guò)程持續(xù)到生長(zhǎng)期Ⅴ/Ⅵ期,停止于退行期早期。在退行期Ⅱ期毛球部PDMC發(fā)生凋亡,持續(xù)到退行期Ⅶ期凋亡殆盡,能觀察到黑素碎片。健康人毛發(fā)著色一直重復(fù)這一過(guò)程,在大約第十個(gè)毛發(fā)生長(zhǎng)周期(40歲左右)這一個(gè)過(guò)程發(fā)生變化,毛球部黑素細(xì)胞數(shù)量減少、活性減弱,不能維持長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)期毛發(fā)著色,因而逐漸產(chǎn)生白發(fā)[l1]。毛發(fā)著色過(guò)程如下：在毛囊生長(zhǎng)期初期,黑素細(xì)胞能夠合成黑素,通過(guò)樹(shù)突狀突起將黑素轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近的毛干皮質(zhì)和髓質(zhì)。進(jìn)入退行期后,黑素細(xì)胞發(fā)生老化甚至凋亡,黑素合成停止,樹(shù)突亦逐漸消失。上皮、間質(zhì)和神經(jīng)外胚層相互作用,共同調(diào)控著毛囊黑素細(xì)胞的代謝和毛干的著色。在黑素轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中,黑素細(xì)胞的樹(shù)突起吞噬、聚集黑素小體并通過(guò)吞泡吐泡作用將其轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近上皮細(xì)胞的作用。這些上皮細(xì)胞與黑素細(xì)胞一樣能夠吞噬、聚集黑素小體,區(qū)別在于這些上皮細(xì)胞并不發(fā)生退化。影響誘發(fā)白發(fā)的因素多種多樣,比如：干細(xì)胞龕微環(huán)境的改變,活性氧及機(jī)體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌因子水平的變化均可誘導(dǎo)產(chǎn)生白發(fā)。然而,在白發(fā)發(fā)生過(guò)程中AMMCs比毛囊中任何類型的黑素細(xì)胞都要不敏感,受到更多保護(hù),存活時(shí)間更長(zhǎng)。因此,無(wú)黑素黑素細(xì)胞是研究毛發(fā)著色及白發(fā)復(fù)色治療最好的細(xì)胞模型。本課題的研究主要包括以下兩個(gè)方面：1,比較FIUE結(jié)合酶消化方法與幾種不同的無(wú)黑素黑素細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法由于毛囊是易于獲取的組織,并含有近12%的干細(xì)胞,在再生醫(yī)學(xué)中,毛囊為自體細(xì)胞療法治療燒傷患者、白癜風(fēng)的復(fù)色治療、或促進(jìn)慢性潰瘍的愈合甚至神經(jīng)再生有著重要作用[14-211。毛囊的黑素細(xì)胞分為兩種類型：分布在漏斗部和毛球部的色素化樹(shù)突狀黑素細(xì)胞(PDMC),及存在毛囊中下部外毛根鞘的無(wú)黑素黑素細(xì)胞(ANMC)。 PDMC已高度分化,增殖能力有限,外毛根鞘來(lái)源的AMMC分化程度低,增殖潛力大。因此,AMMC的體外培養(yǎng)模型可以作為研究白發(fā)、白癜風(fēng)等色素障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ),也可以用來(lái)篩選治療這些疾病的藥物和方法。[目的]比較不同的無(wú)黑素黑素細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。[方法]采用FUE毛囊鉆取技術(shù),加上優(yōu)化的酶消化方法,配以sincecell黑素細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)獲取無(wú)黑素黑素細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為三組,每一組五個(gè)培養(yǎng)樣本,每個(gè)培養(yǎng)皿放置30個(gè)分離消化毛囊進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為三步：第一步,單純酶消化步驟過(guò)程復(fù)雜,為了優(yōu)化便捷獲取單位毛囊過(guò)程,結(jié)合FUE毛囊鉆取技術(shù),講酶消化步奏從三步簡(jiǎn)化至一步,大大縮短酶消化時(shí)間。第二步,在優(yōu)化的單位毛囊獲取方法的基礎(chǔ)上,摸索最適宜的酶消化時(shí)間,縮短細(xì)胞遷出時(shí)間并提高細(xì)胞遷出率。第三步,對(duì)比直接拔取法、酶消化法及FUE+酶消化法：同一批次的毛囊,使用三種不同方式獲取,放置在一樣的培養(yǎng)條件下,比較得出FUE+酶消化法培養(yǎng)的毛囊細(xì)胞遷出率要高于直接拔取法及單純酶消化法,且細(xì)胞遷出時(shí)間更短。將培養(yǎng)出的細(xì)胞通過(guò)免疫熒光和透射電鏡的方法進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]l,FUE+酶消化法的細(xì)胞遷出時(shí)間明顯短于直接拔取培養(yǎng)法及傳統(tǒng)酶消化法,且細(xì)胞遷出率明顯增加。2,配以FUE及酶消化的培養(yǎng)方式,可以簡(jiǎn)化沒(méi)消化步驟,可以節(jié)省近一半的酶消化時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本。3,FUE鉆取的毛囊最佳消化時(shí)間在30min左右。結(jié)合FUE結(jié)合Ⅳ型膠原酶酶消化30min的方式,外毛根鞘細(xì)胞在3-5天開(kāi)始遷出,10天左右遷出達(dá)到高峰。細(xì)胞培養(yǎng)周期由原來(lái)普遍認(rèn)為的4周,縮短至不到3周。因此,本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化培養(yǎng)方式能夠更快的更便捷的獲得無(wú)黑素黑素細(xì)胞。是是S100B、NKI/beteb免疫熒光鑒定結(jié)果為陽(yáng)性,透射電鏡觀察結(jié)果可觀察到黑素小體。[結(jié)論]FUE可以節(jié)省顯微分離單位毛囊的時(shí)間,提高顯微分離的效率,并且簡(jiǎn)化了酶消化的步驟。較之顯微分離的物理?yè)p傷、長(zhǎng)時(shí)間暴露損傷,及單純酶消化的多重酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)獲取的毛囊的損傷更小,活性更強(qiáng)。2,觀察無(wú)黑素黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程的形態(tài)變化,及低氧干預(yù)對(duì)無(wú)黑素黑素細(xì)胞的影響。毛囊中黑素細(xì)胞家族主要分為三類：一是存在毛囊隆突區(qū)域的黑素干細(xì)胞,此類細(xì)胞具有分化能力,作為毛發(fā)生長(zhǎng)周期中黑素細(xì)胞的補(bǔ)給來(lái)源；二是位于外毛根鞘的AMMC,具有細(xì)胞體積小、細(xì)長(zhǎng)且多呈雙極性的特點(diǎn),黑素合成能力低,在體外培養(yǎng)具有很強(qiáng)的增殖能力；再是位于毛球部的PDMC,包饒這毛乳頭,混雜在毛母質(zhì)當(dāng)中,具有細(xì)胞體積大、胞體呈樹(shù)突狀多極性的特點(diǎn),處于高分化狀態(tài),在體外培養(yǎng)過(guò)程中幾乎無(wú)增殖分化能力,但具有合成黑素顆粒的能力。[目的]觀察無(wú)黑素黑素細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)變化及探尋低氧培養(yǎng)對(duì)黑素細(xì)胞的作用。[方法]采用FUE+酶消化培養(yǎng)出的無(wú)黑素黑素細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為兩大部分：第一,記錄0、1、3、5、7代細(xì)胞的形態(tài)變化過(guò)程,拍攝并記錄。將形態(tài)發(fā)生變化的細(xì)胞做免疫熒光染色,鑒定其細(xì)胞特性的改變。第二,將同一批次的第3代無(wú)黑素黑素細(xì)胞做劃痕處理分為兩部分,一部分放入含5%氧含量的低氧培養(yǎng)箱。觀察兩部分細(xì)胞,劃痕實(shí)驗(yàn)的一個(gè)變化,分0、6、12、24小時(shí)觀察細(xì)胞變化,取樣并拍照,根據(jù)劃痕恢復(fù)時(shí)間差別比較兩種條件下細(xì)胞增殖及遷移能力的不同。同時(shí)在兩種培養(yǎng)箱中,傳代培養(yǎng)細(xì)胞,比較兩批細(xì)胞的一個(gè)形態(tài)變化有無(wú)差別,觀察不同培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞形態(tài)及特性的維持作用。[結(jié)果]1,無(wú)黑素黑素細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞形態(tài)由雙極性向樹(shù)突型變化,第6代細(xì)胞開(kāi)始,兩種細(xì)胞類型的主導(dǎo)地位發(fā)生顛覆,將第6、9代,進(jìn)行HMB45抗體免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的細(xì)胞。而無(wú)黑素黑素細(xì)胞作為黑素細(xì)胞前體,在原代培養(yǎng)獲得時(shí)HMB45抗體的染色是陰性的。HMB45抗體陽(yáng)性表達(dá)在黑色素瘤及成熟黑素細(xì)胞中。說(shuō)明無(wú)黑素黑素細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中是在逐漸成熟和分化的。2,在低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的恢復(fù)時(shí)間明顯短于普通細(xì)胞培養(yǎng)箱的細(xì)胞,且無(wú)黑素黑素細(xì)胞形態(tài)基本不發(fā)生形態(tài)變化。[結(jié)論]無(wú)黑素黑素細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中,會(huì)進(jìn)行分化、成熟,從不具備著色能力的黑素細(xì)胞前體,演化為成熟黑素細(xì)胞,也許這正是其作為黑素細(xì)胞庫(kù)的來(lái)源的原因。低氧培養(yǎng)環(huán)境給予了無(wú)黑素黑素細(xì)胞一個(gè)更好的擬生態(tài)環(huán)境,更好的維持了細(xì)胞特性及其活性。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R758.71
【圖文】：

圖２；圖Ａ為消化１５ｍｉｎ時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天時(shí)情況，并不能見(jiàn)細(xì)胞遷出。WＢ為消化３０ｍｉｎ逡逑時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天，可見(jiàn)毛囊外毛根挿周?chē)写罅堪胪该骷?xì)胞遷出，迂出范圍較大。圖Ｃ逡逑為消化６０ｍｉｎ時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天，ｎｊ見(jiàn)毛囊外毛根挿周?chē)屑?xì)胞遷出，但較３0ｍｉｎ時(shí)細(xì)胞逡逑要少。圖Ｄ為消化９０ｍｍ時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天，幾乎不能見(jiàn)細(xì)胞遷出。（１００Ｘ）逡逑１４逡逑

ＡＢ圖１１，Ａ、Ｂ兩圖分別在低氧環(huán)境在下及常氧環(huán)境下Ｐ７ＡＭＭＣ的細(xì)胞形態(tài)。Ａ圖為低氧逡逑環(huán)境，細(xì)胞依然呈雙極性，細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞。Ｂ圖為常氧環(huán)境下，細(xì)胞呈樹(shù)突化。逡逑３．討論逡逑人類毛囊黑素細(xì)胞分為兩個(gè)亞型，一類位于生長(zhǎng)期毛囊毛球部具有黑素合成逡逑

圖２；圖Ａ為消化１５ｍｉｎ時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天時(shí)情況，并不能見(jiàn)細(xì)胞遷出。WＢ為消化３０ｍｉｎ逡逑時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天，可見(jiàn)毛囊外毛根挿周?chē)写罅堪胪该骷?xì)胞遷出，迂出范圍較大。圖Ｃ逡逑為消化６０ｍｉｎ時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天，ｎｊ見(jiàn)毛囊外毛根挿周?chē)屑?xì)胞遷出，但較３0ｍｉｎ時(shí)細(xì)胞逡逑要少。圖Ｄ為消化９０ｍｍ時(shí)，毛囊培養(yǎng)７天，幾乎不能見(jiàn)細(xì)胞遷出。（１００Ｘ）逡逑１４逡逑

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6 簡(jiǎn)丹;己烯雌酚對(duì)黑素合成的影響及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2010年

7 史贏;氧化應(yīng)激對(duì)毛發(fā)著色和皮膚光保護(hù)能力影響研究[D];武漢大學(xué);2014年

8 李艷;補(bǔ)益肝腎法對(duì)小鼠皮膚α-MSH表達(dá)及黑素合成影響研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2012年

9 岳學(xué)狀;部分天然植物成分對(duì)皮膚微循環(huán)、黑素合成以及VEGF分泌的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周穎麗;雌二醇聯(lián)合UVB照射對(duì)表皮中黑素小體代謝的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 陳超越;不同的分離方法及培養(yǎng)條件對(duì)無(wú)黑素黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

3 孫弦;左旋多巴對(duì)馬爾尼菲青霉黑素合成的影響、藥敏及其黑素抗體的制備[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

4 郭婷;馬爾尼菲青霉酵母細(xì)胞黑素的分離純化及理化性質(zhì)的分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

5 李虎;維生素對(duì)人A375黑素瘤細(xì)胞株黑素合成的影響[D];南華大學(xué);2013年

6 韓景濤;氫化可的松對(duì)人A375黑素瘤細(xì)胞株黑素合成的影響[D];南華大學(xué);2007年

7 劉雅男;中藥白斑一號(hào)對(duì)黑素細(xì)胞代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

8 劉利利;單味中藥脫色及復(fù)方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)人A375黑素瘤細(xì)胞黑素代謝影響的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

9 武松江;補(bǔ)骨脂聯(lián)合NB-UVB對(duì)人A375黑素瘤細(xì)胞增殖及黑素合成的影響[D];南華大學(xué);2014年

10 喬珍;促黑素對(duì)骨代謝的影響[D];濱州醫(yī)學(xué)院;2013年

本文編號(hào)：2806655