【摘要】： 目的 皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡稱皮膚鱗癌,起源于表皮和皮膚附屬器的角質(zhì)形成細(xì)胞,是侵襲性癌,其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不十分清楚。HaCaT細(xì)胞系源于人類表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞,SCL-1細(xì)胞系源于人皮膚鱗狀細(xì)胞癌的瘤細(xì)胞,因而它們分別是研究人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)的理想模型。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)可以高通量發(fā)現(xiàn)不同組織細(xì)胞間蛋白質(zhì)的變化,而且可以通過特異性的差異蛋白作為疾病診斷治療的分子標(biāo)記。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)核心技術(shù)雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析和鑒定HaCaT細(xì)胞系和SCL-1細(xì)胞系的差異蛋白,為闡明皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制并為其診斷治療提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.HaCaT細(xì)胞系與SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的建立及其差異分析 1.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、5%CO_2條件下,用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL)分別培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞和SCL-1細(xì)胞于75cm~2培養(yǎng)瓶中,當(dāng)細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,分別收集HaCaT細(xì)胞和SCL-1細(xì)胞后,室溫下PBS液沖洗、1 000 r/min離心三次,收集細(xì)胞-70℃凍存或立即用于樣品制備。 1.2制備蛋白質(zhì)樣品 將收集到的細(xì)胞與裂解液按1:5體積的比例混勻,冰浴靜止反應(yīng)一小時(shí)后,12 000 r/min、15℃離心1h,收集上清液,Bradford法測定其蛋白濃度,分裝,-70℃保存?zhèn)溆谩?1.3等電聚焦 使用17cm(pH 3～10L,pH 4～7L,pH 5～8L)IPG膠條,在PROTEANIEF等電聚焦儀上聚焦,上樣量為1.2mg,上樣體積為350ul。50V,20℃主動水化13h;250V線性升壓30min、1 000V快速升壓1h;10 000V線性升壓5h;10 000V快速升壓60 000Vh。每根膠條的極限電流為50μA,等電聚焦的溫度為20℃。 1.4平衡與SDS-PAGE電泳 經(jīng)兩步平衡后SDS-PAGE電泳,30v 30min,加壓至120v,直到溴酚藍(lán)泳至玻璃板前緣0.5cm止。 1.5染色和圖像分析 考馬斯亮蘭染色后,利用Image Master 2D 4.10軟件對HaCaT細(xì)胞與SCL-1細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)差異分析。 1.6選擇清晰匹配差異點(diǎn)手工切取后進(jìn)行質(zhì)譜分析 2.HaCaT細(xì)胞系與SCL-1細(xì)胞系差異蛋白鑒定分析 2.1蛋白質(zhì)組差異分析 重點(diǎn)分析HaCaT細(xì)胞系與SCL-1細(xì)胞系高差異蛋白 2.2選取12個(gè)差異點(diǎn)作質(zhì)譜測定 選取原則是:可重復(fù),非邊緣化,斑點(diǎn)清楚,匹配關(guān)系肯定,肉眼可見。所獲質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢,再綜合表觀分子量、等電點(diǎn)判定結(jié)果。 先將考染蛋白樣品酶解,然后提取肽段,再在N_2下吹干濃縮,最后進(jìn)行MALDI-TOF-TOF MS蛋白鑒定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.建立了HaCaT細(xì)胞系和SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜。 2.在pH 4～7L IPG膠條上,HaCaT細(xì)胞系和SCL-1細(xì)胞系中分別檢測到(690±39)個(gè)和(665±31)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),其中匹配的蛋白點(diǎn)為396±34)個(gè),三張同一樣本(HaCaT細(xì)胞系及SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)樣本)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配率分別為72.6%和71.9%。 3.對表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,初步鑒定在HaCaT細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的蛋白是:prohibitin;dUTP焦磷酸酶;chain B,the 2.1 a structure of a tumour suppressing serpin;eukaryotic translation initia-tion factor 3,subunit 2 beta;sfrsl protein。在SCL-1細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的蛋白是:原肌球蛋白-4,熱休克蛋白-27,磷酸丙糖異構(gòu)酶;KRTHB1;chainB,X-ray crystal structure of human galectin-1。 結(jié)論 獲得了重復(fù)性好的HaCaT細(xì)胞系與SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜,兩個(gè)蛋白質(zhì)組間蛋白質(zhì)有差異。鑒定了部分差異蛋白質(zhì),為闡明皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制并為其診斷治療提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2800239