【摘要】：西蘭花種子中的硫代葡萄糖苷(GLS)經(jīng)黑芥子酶或硫苷酶水解可得到具有多種生物活性的異硫氰酸酯(ITCs),其中的4-甲硫基丁基異硫氰酸酯(Erucin)和蘿卜硫素(Sulforaphane,SF)具有防癌和抗癌的作用,SF的抗癌活性比Erucin更高。為了提高西蘭花種子中ITCs中活性物質(zhì)的含量以及研究蘿卜硫素誘導(dǎo)小鼠黑色瘤B16細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,本論文以西蘭花和小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞為對象,研究了提取方式對西蘭花種子中ITCs含量的影響、不同清炒方式對西蘭花ITCs含量及對B16細(xì)胞中醌氧化還原酶(NQO1)活性的影響,以及初步探討了SF誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:(1)以西蘭花種子為研究對象,研究先酶解再提取(Enzymatic hydrolysis before extraction,EBE)、酶解和提取同時進(jìn)行(Enzymatic hydrolysis and extraction simultaneously,EES)兩種方式對提取液中ITCs含量的影響。結(jié)果表明,以西蘭花種子為原料時,EBE組與EES組中的總ITCs的含量無顯著性差異(P0.05),但EES組中的Erucin含量顯著提高(P0.05)。以未純化黑芥子酶和蘿卜硫苷為研究對象也得出類似結(jié)論。但是以純黑芥子酶和蘿卜硫苷為研究對象時,兩種提取方式對提取液中ITCs和Erucin含量無顯著影響(P0.05)。(2)清炒是我國常用的西蘭花烹飪方法。本論文以小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞為對象,研究新鮮西蘭花(Raw broccoli,RB)、直接炒西蘭花(Direct stir-fried broccoli,DS)、酶解后再炒的西蘭花(Hydrolyzed and sir-fried broccoli,HS)的提取物對ITCs含量的影響、對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞抑制作用,以及對B16細(xì)胞醌還原酶(Quinone reductase,QR/NAD(P)H:reductase 1,NQO1)活性的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明,各組西蘭花提取物對B16細(xì)胞的抑制作用無顯著差異(P0.05);RB和HS組提取物能顯著提高ITCs含量和B16細(xì)胞NQO1的活性,與DS組存在顯著性的差異(P0.05)。(3)利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測SF對B16細(xì)胞自噬小體形成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5μM、10μM的SF對自噬小體的形成無明顯影響,20μM和30μM的SF能明顯促進(jìn)B16細(xì)胞自噬體的生成。(4)研究了SF對B16細(xì)胞中的Atg5、LC3蛋白的表達(dá)以及SF誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬與PI3K/ERK/AMPK信號通路的關(guān)系,結(jié)果表明,SF能上調(diào)Atg5和LC3蛋白的表達(dá),SF可通過PI3K/ERK信號通路誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬,PI3K/ERK/AMPK信號通路抑制劑能促進(jìn)SF誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用,但當(dāng)SF的濃度較低時,抑制AMPK信號通路對B16的細(xì)胞凋亡無明顯的影響。
【學(xué)位授予單位】：浙江科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.5;TS255.1
【圖文】：

圖 1.1 硫苷的結(jié)構(gòu)Fig 1.1 Structure of glucosinolates生物活性咀嚼、機(jī)械破碎時，GLS 被內(nèi)源性黑芥子泛的生物活性，既包括有益的，也包括有害異硫氰酸酯作為典型的親脂類物質(zhì)，能透過響細(xì)胞的代謝功能，抑制微生物的增殖[10]物的作用[11]。王巖等人以金黃色葡萄球菌和氰酸芐酯（BITC）、異硫氰酸苯乙酯（PEI兩種菌的生長有明顯的抑制效果[12]。從芥子黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞作用，且對革蘭氏陽性菌的抑制能力明顯強(qiáng)菌特性，為異硫氰酸酯作為抗菌劑提供了理

過 Western blot 檢測自噬標(biāo)志性蛋白 LC3II 和 LC3I 條帶的濃度可以反映自噬的程度。LY294002 是首個合成的已知抑制 PI3K / /β 的小分子，不僅能夠結(jié)合 classI PI3Ks 和其他 PI3K 相關(guān)的激酶，還能夠結(jié)合一些與 PI3K 家族無關(guān)的新型靶點(diǎn)，因此常用來作為 PI3K 信號通路的抑制劑。采用不同濃度的 SF（有無 PI3K 信號通路抑制劑）作用 B16 細(xì)胞 24 h，RAPA、3-MA 分別為陽性對照和陰性對照，從圖中可以看出（圖 4.2），空白對照組（0μM，僅含培養(yǎng)基）與各實(shí)驗(yàn)組（SF 濃度分別為 5 μM、10 μM、20 μM、30 μM）相比，LC3I、LC3II 蛋白的表達(dá)隨著藥物濃度的增加，表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢，而加入了 LY49002 的 SF 作用細(xì)胞，LC3I、LC3II 的表達(dá)明顯低于只有 SF 作用的細(xì)胞，并且 LC3II 相對于 LC3I 的灰度降低，抑制 PI3K 信號通路可降低 B16細(xì)胞的自噬水平，說明 SF 能通過 PI3K 信號通路誘導(dǎo) B16 細(xì)胞自噬。低濃度 SF作用 B16 細(xì)胞，Atg5 蛋白變化不顯著，20 μM、30 μM 的 SF 作用細(xì)胞后，Atg5條帶明顯增強(qiáng)。

PD98059 是一種選擇性的和可逆的 ERK 通路的抑制劑，作用于基底 MEK（GST-MEK1）和部分激活的 MEK（218 和 222 殘基由絲氨酸突變?yōu)楣劝彼幔珿ST-MEK-2E）。實(shí)驗(yàn)中選取兩組細(xì)胞，第一組為 5 μM、10 μM、20 μM、30 μM的 SF、第二組加了 ERK 信號通路抑制劑的各濃度的 SF，RAPA、3-MA 為陽性對照和陰性對照以及空白組（只含培養(yǎng)基），從圖中可知（圖 4.3），不含 ERK信號通路的 SF 組和加 ERK 信號通路的 SF 組，LC3I、LC3II 以及 Atg5 蛋白的表達(dá)隨 SF 濃度增高依次增加，RAPA 誘導(dǎo)了 B16 細(xì)胞的自噬，3-MA 抑制了 B1細(xì)胞的自噬水平，只加 ERK 信號通路抑制劑的細(xì)胞組，降低 LC3I 蛋白的表達(dá)、對 LC3II 蛋白無顯著作用，增強(qiáng)了 Atg5 蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，抑制 ERK 信號通路，可抑制萊菔硫烷誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，表明 ERK 信號通路在萊菔硫烷誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中起重要作用。

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本文編號：2797358