【摘要】：研究背景皮膚光老化(skinphotoaging)是指日光中的紫外線照射皮膚后引起的慢性炎癥過(guò)程。引起光老化的紫外線主要是長(zhǎng)波紫外線(UVA)、中波紫外線(UVB)。目前,由于環(huán)境污染、臭氧層被破壞,人們接受紫外線輻射、光老化問(wèn)題日益嚴(yán)重,成為困擾大眾的一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。因此開(kāi)發(fā)具有高活性成分的防曬產(chǎn)品以及具有抗氧化活性的藥物來(lái)抵抗紫外線的輻射,預(yù)防和延緩皮膚老化已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。楊梅為楊梅科楊梅屬植物,果實(shí)甜酸可口,自古以來(lái)就被用于食療。近年來(lái)已經(jīng)證明楊梅提取物中的楊梅黃酮是發(fā)揮藥理作用的主要化學(xué)成分之一。楊梅黃酮具有多種生物學(xué)活性,包括抗癌防癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等等。也有研究顯示楊梅黃酮可用作皮膚的光保護(hù)劑。但是楊梅黃酮對(duì)紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化保護(hù)作用及潛在機(jī)制尚不清楚。研究目的1、通過(guò)建立體外光老化模型,探索紫外線照射對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)和增殖,氧化損傷作用以及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1表達(dá)的影響。2、探討楊梅黃酮對(duì)紫外線引起的表皮真皮結(jié)構(gòu)和各種代謝改變的保護(hù)作用,進(jìn)一步探討其保護(hù)機(jī)制。研究方法第一部分:楊梅黃酮對(duì)紫外線照射后的原代成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用取新鮮皮膚組織用Dispase酶消化,分離上皮和真皮層成纖維細(xì)胞,采用組織塊貼壁法培養(yǎng)真皮層成纖維細(xì)胞。紫外照射劑量分別為UVA+UVB(5mJ/cm2)、UVA+UVB(15mJ/cm2)、UVA+UVB(30mJ/cm2)、UVA+UVB(60mJ/cm2),觀察細(xì)胞存活率以及細(xì)胞形態(tài),選擇照射劑量UVA+UVB(15mJ/cm2)建立成纖維細(xì)胞紫外線照射后的光損傷模型。分別用不同濃度楊梅黃酮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,24小時(shí)后,以UVA+UVB(15mJ/cm2)進(jìn)行照射,照射后繼續(xù)以相應(yīng)濃度楊梅黃酮孵育24小時(shí)后,觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞存活率,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,比色法檢測(cè)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)MMP-1分泌水平。第二部分:楊梅黃酮通過(guò)IκB/NF-κB信號(hào)通路抑制UVB輻射對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷分別采用不同UVB照射劑量(0、15、20、25、30mJ/cm2)照射人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT,采用MTT方法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞的活力。選擇20mJ/cm2(HaCaT細(xì)胞的活性降低將近50%)作為造模劑量,UVB照射后分別用不同濃度楊梅黃酮和生理鹽水(對(duì)照組)處理細(xì)胞。采用MTT方法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞的活力,流式細(xì)胞術(shù)分析UVB輻射下的細(xì)胞的ROS含量,運(yùn)用Western Blot和RT-PCR分別檢測(cè)NF-KB信號(hào)通路標(biāo)志蛋白pIκB和IκB及下游蛋白COX2蛋白及mRNA表達(dá)水平。第三部分:楊梅黃酮對(duì)紫外線所誘導(dǎo)的小鼠皮膚光損傷的保護(hù)作用50只白色雄性小鼠剃除背部絨毛,隨機(jī)分為5組,每組10只:A組:空白對(duì)照組;B組:UVA+UVB照射;C組:UVA+UVB照射+楊梅黃酮低濃度組(5mg/ml);D組:UVA+UVB照射+楊梅黃酮中濃度組(20mg/ml);E組:UVA+UVB照射+楊梅黃酮高濃度組(50mg/ml)。小鼠經(jīng)均勻涂抹生理鹽水(對(duì)照組)或楊梅黃酮30min后,每組均隔日照射UVA+UVB1次,照射強(qiáng)度UVB為0.18mW/cm2,UVA為1.25mW/cm2,第1周到第7周每次照射時(shí)間為30min,自第8周開(kāi)始后照射時(shí)間每周延長(zhǎng)1Omin,到第12周時(shí)照射時(shí)間為80min,到14周停止紫外線照射(最終UVA輻射劑量累計(jì)為139.86J/cm2,UVB輻照劑量累計(jì)為21.38J/cm2)。在紫外線照射過(guò)程中,定期觀察各組小鼠背部皮膚,試驗(yàn)結(jié)束后采用Glogau法對(duì)小鼠背部皮膚進(jìn)行分級(jí)。末次UVA十UVB照射實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取小鼠背部照射區(qū)皮膚組織進(jìn)行HE染色和膠原纖維染色,倒置顯微鏡觀察小鼠背部皮膚組織形態(tài)學(xué)及真皮內(nèi)膠原纖維的變化。照射區(qū)皮膚檢測(cè)SOD、HYP、T-AOC水平。提取照射區(qū)皮膚組織總RNA,通過(guò)RT-PCR測(cè)定MMP-1及IκB mRNA表達(dá)水平。研究結(jié)果第一部分:楊梅黃酮對(duì)紫外線照射后造成的原代成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與空白對(duì)照組相比,UVA/UVB輻射組成纖維細(xì)胞后,隨著輻射劑量的增加,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,并且表現(xiàn)出解體、排列紊亂、脫顆�，F(xiàn)象。隨著輻射量的提升,成纖維細(xì)胞(fibroblast,FB)的存活率明顯變小。即紫外線輻射可以損傷FB細(xì)胞的活力,致其凋亡壞死。與單純照光組相比,楊梅黃酮給藥組FB細(xì)胞的活力隨著楊梅黃酮濃度的增加而逐漸升高。與正常對(duì)照組相比,UVA/UVB輻射后膠原蛋白分泌量降低,用楊梅黃酮處理后發(fā)現(xiàn),楊梅黃酮濃度在50μg/ml以下時(shí)可提升紫外線照射后成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中總膠原分泌量。在濃度為50μg/ml時(shí),總膠原分泌量顯著增加(P0.05)。研究還發(fā)現(xiàn)楊梅黃酮濃度為50μg/ml時(shí)可以顯著抑制成纖維細(xì)胞中的MMP-1分泌(P0.05),而當(dāng)楊梅黃酮濃度大于100μg/ml以上時(shí),MMP-1的分泌水平較單純照射組反而增加。第二部分:楊梅黃酮通過(guò)IκB/NF-κB信號(hào)通路抑制UVB輻射對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷UVB劑量的逐漸增加,HaCaT細(xì)胞的存活率隨之降低(P0.05)。即UVB輻射可以損傷HaCaT細(xì)胞的活力,致其凋亡壞死。當(dāng)輻射量達(dá)到20mJ/cm2,HaCaT細(xì)胞的活性降低將近50%。我們選擇20mJ/cm2的UVB照射HaCaT細(xì)胞,采用不同楊梅黃酮(0、5、15、25、35、50μM)處理細(xì)胞,結(jié)果表明,與生理鹽水對(duì)照組相比,HaCaT細(xì)胞的活力隨著楊梅黃酮的濃度升高而逐漸提高。低濃度的楊梅黃酮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用不顯著(P0.05),而楊梅黃酮濃度達(dá)到50μM時(shí),HaCaT細(xì)胞的存活率可達(dá)80%左右。經(jīng)UVB照射后,HaCaT細(xì)胞的ROS水平上調(diào),不同濃度的楊梅黃酮可逐漸降低HaCaT細(xì)胞的ROS水平,表明楊梅黃酮可以有效抑制UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的ROS水平。紫外線照射后的HaCaT細(xì)胞的COX2 mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)(P0.05),楊梅黃酮可以有效抑制UVB輻射誘導(dǎo)的COX2 mRNA和蛋白水平,且隨著楊梅黃酮含量的升高,COX2的mRNA和蛋白水平逐漸降低。UVB照射后,細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路標(biāo)志蛋白pIκB水平表達(dá)上調(diào)(P0.05),IκB未產(chǎn)生明顯變化(P0.05),當(dāng)采用50μM的楊梅黃酮處理細(xì)胞,PIκB表達(dá)被抑制,IκB未產(chǎn)生明顯變化。第三部分:楊梅黃酮對(duì)紫外線所誘導(dǎo)的小鼠皮膚光損傷的保護(hù)作用白色小鼠背部皮膚脫毛給予UVA+UVB連續(xù)照射14周后,背部皮膚出現(xiàn)明顯光老化改變:成纖維細(xì)胞損傷甚至破碎,膠原纖維斷裂,排列紊亂,膠原纖維含量下降,同時(shí)伴有單核炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。照射前分別外用濃度為5mg/ml、20mg/ml、50mg/ml的楊梅黃酮涂抹,結(jié)果顯示楊梅黃酮可以不同程度地減輕膠原纖維變性,膠原纖維破壞減少,排列趨于整齊,含量升高,同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(P0.05)。小鼠皮膚經(jīng)紫外線照射后抗氧化酶SOD、T-AOC的活性均有所下降,涂抹楊梅黃酮后各組抗氧化酶活性均有所升高(P0.05)。超氧化物歧化酶SOD各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05),當(dāng)楊梅黃酮濃度為5mg/ml,T-AOC活性明顯升高,HYP含量顯著升高。當(dāng)濃度為5mg/ml、20mg/ml 時(shí),MMP-1 mRNA 水平顯著升高(P0.05)。結(jié)論楊梅黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)紫外線照射的皮膚光損傷有一定的防護(hù)作用;楊梅黃酮可以增強(qiáng)照射后細(xì)胞的增殖活力、提高氧化酶活性;并且楊梅黃酮通過(guò)IκB/NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞因子MMP-1的分泌來(lái)發(fā)揮抗皮膚光老化的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R758.1
【圖文】：

圖２楊梅黃酮可以抑制ＵＶＢ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡逡逑注：＊表示Ｐ＜０．０５逡逑２、楊梅黃酮可以顯著降低ＵＶＢ輻射誘導(dǎo)的ＲＯＳ水平逡逑采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析在ＵＶＢ輻射下的ＲＯＳ含量以及經(jīng)過(guò)楊梅黃酮逡逑處理后ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平變化（圖３）。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)ＵＶＢ輻射之后，逡逑ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平顯著上調(diào)（Ｐ＜０．０５），但是經(jīng)過(guò)不同濃度的楊梅黃酮處理逡逑之后發(fā)現(xiàn)，ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平逐漸降低，當(dāng)達(dá)到楊梅黃酮的濃度達(dá)到逡逑５0ｎＭ時(shí)，ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平相比對(duì)照組基本持平，表明楊梅黃酮可以有逡逑效抑制ＵＶＢ輻射誘導(dǎo)ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平。逡逑

」ＢＩ邐Ｈｉ邐ｍｍ邐■！邐ＢＢＬ邐＃邋0邋ｂ0邋丨邋５邐２０邐２５邐３０邐，邐瞧邋２０ｍ圖２楊梅黃酮可以抑制ＵＶＢ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡逡逑注：＊表示Ｐ＜０．０５逡逑酮可以顯著降低ＵＶＢ輻射誘導(dǎo)的ＲＯＳ水平逡逑流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析在ＵＶＢ輻射下的ＲＯＳ含量以及經(jīng)過(guò)ａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平變化（圖３）。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)ＵＶＢ輻胞的ＲＯＳ水平顯著上調(diào)（Ｐ＜０．０５），但是經(jīng)過(guò)不同濃度的楊梅，ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平逐漸降低，當(dāng)達(dá)到楊梅黃酮的，ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平相比對(duì)照組基本持平，表明楊梅黃ＶＢ輻射誘導(dǎo)ＨａＣａＴ細(xì)胞的ＲＯＳ水平。逡逑

逡逑蛋白，用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的ｐｌｔｃＢ和ＩｋＢ蛋白表達(dá)（圖５）。結(jié)果發(fā)逡逑現(xiàn)，ＵＶＢ輻射后，細(xì)胞內(nèi)的ＰＩｋＢ水平表達(dá)顯著上調(diào)，ＩｋＢ未產(chǎn)生明顯變化，當(dāng)逡逑采用５０ｐＭ的楊梅黃酮處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ｐＩｊｃＢ表達(dá)被抑制，ＩｋＢ仍未產(chǎn)生顯著的逡逑變化。因此，我們推測(cè)楊梅黃酮可能是通過(guò)ＮＦ－ｋＢ信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制紫外輻逡逑射對(duì)細(xì)胞的損傷作用。逡逑ＵＶＢ邋２０邋ｒｎＪＷ逡逑知邋５邋Ｔ邐ｃｏｎｔｒｏｌ邋０邐５０邋（曊逡逑２邐４－５邋—？邐Ｉ逡逑？Ｓ邋４邋－？邐｜逡逑ｇ邋ｒｔ邋３邋－－邐ｐ－ｌＫＤ0ｔ逡逑Ｐ；１：：邐■逡逑Ｉ邐}楨澹椋蓿攏徨澹恚恚恚停恚恚恚恚恚礤義

本文編號(hào)：2782906