發(fā)布時間：2020-07-28 08:38

【摘要】：背景和目的近年來人們的脫發(fā)發(fā)病率逐漸增長,嚴(yán)重影響患者的身心健康。治療脫發(fā)方法包括自體毛囊移植術(shù)、口服非那雄胺、外用米諾地爾等,但存在副作用、停藥后脫發(fā)進(jìn)程會繼續(xù),因此探索新的有效的方法有必要。關(guān)于其實(shí)驗研究包括組織工程毛囊重建、毛囊細(xì)胞克隆、毛囊細(xì)胞移植療法等,其中得益于組織工程研究發(fā)展迅猛,毛囊重建在治療脫發(fā)的研究中較有前景。毛囊的重建需要大量及具有生物學(xué)活性的種子細(xì)胞,包含有毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells,HFSC)及毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells,DPC)。毛囊是皮膚附屬器的器官,由真皮組分和表皮組分組成。DPC聚集在毛乳頭(DP)內(nèi),DP在毛球部被毛母質(zhì)細(xì)胞等包繞。HFSC與DPC相互作用形成新的毛囊,DPC被認(rèn)為是毛囊形態(tài)發(fā)生和周期性生長必需的。但DPC在體外經(jīng)過多次擴(kuò)增培養(yǎng),它的生物學(xué)活性逐漸消失,因此,改善或維持DPC在體外培育擴(kuò)增后的誘導(dǎo)活性,是組織工程毛囊重建中重要一步。外泌體,為來源細(xì)胞通過旁分泌細(xì)胞外排形成的囊泡,直徑約為30-150nm,其內(nèi)攜帶有來源細(xì)胞的DNA、RNA、多種蛋白質(zhì)等物質(zhì),可存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血液等。因此我們在本實(shí)驗中通過使用低代數(shù)DPC來源的外泌體培養(yǎng)高代數(shù)DPC,嘗試以其改善DPC的生物學(xué)活性,為毛囊重建提供有效的種子細(xì)胞,為脫發(fā)治療提供新的研究思路。方法:1.鼠觸須墊DPC的分離培養(yǎng)及外泌體的提取與鑒定通過顯微解剖+酶消化法獲取小鼠觸須墊的DP,觀察其形態(tài)、貼壁和遷出情況,并對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)擴(kuò)增。收集低代數(shù)DPC的培養(yǎng)上清液并通過超速離心法提取外泌體,并采用粒徑檢測、電鏡觀察和外泌體表面標(biāo)志蛋白檢測鑒定。2.外泌體培養(yǎng)DPC對其生物學(xué)活性的檢測通過添加外泌體培養(yǎng)第3代(P3)和第8代(P8)的DPC,并通過CCK8、qRT-PCR、WB檢測其生物學(xué)活性。3.經(jīng)外泌體培養(yǎng)的DPC誘導(dǎo)毛囊再生的研究使用外泌體培養(yǎng)后的DPC及新生鼠的上皮細(xì)胞通過注射法進(jìn)行毛囊重建,通過體視鏡、組織切片HE染色觀察情況。結(jié)果:1.通過顯微解剖+酶消化法能獲取小鼠觸須墊的DP,細(xì)胞正常遷出,擴(kuò)增培養(yǎng)后DPC呈聚集性生長,但隨著傳代次數(shù)的增加,DPC逐漸失去聚集性生長的特性,且細(xì)胞增殖能力減弱。通過超速離心法能提取出直徑30-150nm、表達(dá)特異性標(biāo)志蛋白的外泌體。2.添加外泌體培養(yǎng)不同代數(shù)的DPC結(jié)果顯示P3、P8實(shí)驗組細(xì)胞增殖能量較對照組高,P3、P8實(shí)驗組細(xì)胞的相對特異性標(biāo)記物也較對照組的表達(dá)水平高。3.使用外泌體培養(yǎng)的P3和P8的DPC用于毛囊重建,可見P3實(shí)驗組及對照組均能誘導(dǎo)毛囊再生,而P8組僅實(shí)驗組能誘導(dǎo)毛囊重建,且再生毛囊數(shù)量少。結(jié)論:1.通過顯微解剖+酶消化法可獲取小鼠觸須墊的DP,并未影響細(xì)胞遷出及DPC的形態(tài)、生長特性和增殖活性。通過粒徑檢測、電鏡觀察和外泌體表面標(biāo)志蛋白檢測鑒定使用超速離心法可提取出較純豐富的外泌體。2.添加外泌體培養(yǎng)不同代數(shù)的DPC,可部分改善DPC的生物學(xué)活性。3.使用外泌體培養(yǎng)的高代數(shù)DPC仍能誘導(dǎo)毛囊再生。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R758.71
【圖文】：

邐第一章邋Ｃ５７ＢＬ／６小鼠觸須墊毛乳頭細(xì)胞來源的外泌體的提取及鑒定邐逡逑ｍｕｍ邋ｍｍ逡逑圖１－１邋Ｃ５７ＢＬ／６小鼠觸須墊原代毛乳頭培養(yǎng)及觀察。Ａ．顯微解剖＋酶消化法獲得的鼠毛逡逑乳頭（２００Ｘ）；邋Ｂ．原代毛乳頭接種貼壁１天后（４０Ｘ）；邋Ｃ．原代毛乳頭家中貼壁５天后（４０逡逑Ｘ）；邋Ｄ．原代毛乳頭家中貼壁５天后（４０Ｘ）。比例尺＝５００邋ｕｍ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｄｅｒｍａｌ邋ｐａｐｉｌｌａｅ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｔｅｎｔａｃｌｅ邋ｐａｄ邋ｉｎ逡逑ｖｉｔｒｏ．邋Ａ．ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ＤＰ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ２００邋ｔｉｍｅｓ邋；Ｂ．邋ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ＤＰ邋ａｆｔｅｒ邋１逡逑ｄａｙ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ４０邋ｔｉｍｅｓ；邋Ｃ．邋ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ＤＰ邋ａｆｔｅｒ邋５邋ｄａｙｓ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ４０邋ｔｉｍｅｓ；逡逑Ｄ．邋ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ＤＰ邋ａｆｔｅｒ邋７邋ｄａｙｓ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ４０邋ｔｉｍｅｓ，邋ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ：邋５００叫ｎ．逡逑

■■■■■■逡逑ｆ逡逑■逡逑圖１－２Ｃ５７ＢＬ／６小鼠觸須墊各代數(shù)毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)及生長特性觀察。Ａ．Ｐｌ－ＤＰＣ，可逡逑見明顯的細(xì)胞聚集性生長；Ｂ．Ｐ３－ＤＰＣ，亦可見細(xì)胞聚集性生長；Ｃ．Ｐ５－ＤＰＣ，細(xì)胞仍呈聚集性逡逑生長；Ｄ．Ｐ６－ＤＰＣ，細(xì)胞聚集性生長現(xiàn)象較低代數(shù)的明顯減少；Ｅ．Ｐ８－ＤＰＣ，無明顯的細(xì)胞聚集；逡逑Ｆ．Ｐ１０－ＤＰＣ，未見細(xì)胞聚集，且細(xì)胞呈衰老現(xiàn)象。（１００Ｘ）比例尺＝２００邋ｕｍ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ＤＰＣ邋ｅａｃｈ邋ｐａｓｓａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ．邋Ａ．ＰＩ逡逑１４逡逑

圖１－４外泌體的鑒定

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本文編號：2772632