【摘要】：目的:探討低氧環(huán)境、Nodal抑制劑(SB-431542)對黑色素瘤細胞增殖的影響;探討低氧環(huán)境、SB-431542對黑色素瘤細胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)同工酶亞基(LDH-A、LDH-B)、Nodal(Nodal growth differentiation factor)及其受體ALK4(Activin receptor-like kinase4)、ALK7(Activin receptor-like kinase7)蛋白的表達及LDH同工酶譜的影響;探討低氧環(huán)境、SB-431542是否通過影響LDH、Nodal及其受體的表達來影響黑色素瘤(Malignant melonoma,MM)的發(fā)生發(fā)展過程;以及探討LDH、Nodal在黑色素瘤能量代謝方面是否具有相關性;從而為黑色素瘤在臨床上的診斷及治療提供新的思路。方法:在體外使用氯化鈷誘導黑色素瘤細胞A375低氧,構建低氧模型,模擬其在人體內(nèi)生存的微環(huán)境。用SB-431542干預細胞,通過MTT法檢測低氧環(huán)境、SB-431542對A375細胞增殖活性的影響,探索細胞增殖的最適作用濃度及最佳作用時間。采用Western Blot的方法檢測低氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor,HIF-1α)蛋白表達水平,根據(jù)其表達水平的高低以明確低氧模型是否制造成功,并檢測低氧環(huán)境及SB-431542對LDH-A、LDH-B、Nodal及其受體ALK4、ALK7蛋白表達的影響;采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測低氧環(huán)境、SB-431542對乳酸脫氫酶同工酶譜活性的影響。結果:1.MTT法檢測CoCl_2誘導形成的低氧環(huán)境對黑色素瘤A375細胞的增殖的影響:Co Cl_2在適宜濃度范圍內(nèi)(50-200uM)對細胞增殖無明顯抑制作用(P0.05),當超過一定的濃度范圍(250uM)后隨著其作用濃度和作用時間的的增加,表現(xiàn)出抑制作用。當CoCl_2的濃度為150uM時,細胞增殖在48h達高峰。SB-431542對MM細胞增殖的影響:當SB-431542作用濃度逐漸增加,作用時間逐漸延長,細胞的增殖能力呈現(xiàn)下降的趨勢。濃度小于10uM抑制作用較弱;濃度為10-20uM表現(xiàn)出一定的抑制作用;當濃度超過30uM后呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。CoCl_2與SB-431542共同作用對細胞增殖的影響:當SB-431542作用濃度為10uM恒定不變時,CoCl_2的濃度在50-150uM范圍內(nèi)對細胞增殖無抑制作用(P0.05),當CoCl_2濃度超過200uM后表現(xiàn)出明顯抑制作用。當SB-431542作用濃度為10uM,同時CoCl_2作用濃度為150uM時,細胞的增殖在48h達最高峰。2.Western Blot技術檢測結果顯示:適宜濃度的CoCl_2成功誘導A375細胞形成低氧模型后,HIF-1α呈現(xiàn)高表達,同時可見LDH-A、Nodal、ALK4、ALK7蛋白的高表達,LDH-B蛋白低表達(P0.05),SB-431542可上調(diào)LDH-B蛋白表達,下調(diào)LDH-A、Nodal、ALK4、ALK7蛋白的表達(P0.05)。3.瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:低氧環(huán)境可增加LDH同工酶譜中LDH5的活性,而SB-431542可降低LDH5的活性(P0.05)。結論:1.適宜濃度的Co Cl_2在適宜時間可成功誘導黑色素瘤細胞低氧環(huán)境模型。低氧環(huán)境具有促進黑色素瘤細胞增殖及能量代謝的作用,其機制可能與HIF-1α、LDH-A、Nodal及其受體的高表達,LDH-B的低表達有關。2.SB-431542具有抑制黑色素瘤細胞增殖及能量代謝的作用,其機制可能與LDH-A、Nodal及其受體表達下調(diào),LDH-B表達上調(diào)有關。因此,SB-431542有可能成為一種新型的抗黑色素瘤的藥物。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5
【圖文】：

MTT 法檢測黑色素瘤 A375 細胞的增殖情況TT 法檢測不同濃度 CoCl2、SB-431542 對黑色素瘤 A375 細胞增殖。.1 CoCl2對黑色素瘤 A375 細胞增殖的影響各組 CoCl2干預人 MM 細胞形態(tài)無變異。在不同的時間分別測定吸光光度值，結果見圖 1-1。采用單因素方差分析，方差齊性檢驗 0.138＞0.05，證明方差是齊性的。F 值為 4.298，P<0.05，差異有意義。組間兩兩進一步分析，24h 與 48h 相比較，差異具有統(tǒng)計學P<0.05）；48h 與 72h 相比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）； 72h 間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

CoCl2處理濃度（umol/L)圖 1-2 CoCl2對 MM 細胞增殖活性的影響(*P<0.05,**P<0.01)igure1-2：The effect of hypoxia induced by CoCl2at different concentration on prof human MM cells in groups and times.2 SB-431542 對黑色素瘤 A375 細胞增殖的影響各組 SB-431542 干預 MM 細胞形態(tài)無變異。在不同的時間分別的吸光光度值，結果見圖 2-1。單因素方差分析顯示，方差齊性為 0.169＞0.05，說明方差是齊性的。F 值為 11.001，P<0.05，差學意義。組間兩兩進一步分析顯示，24h 與 48h 相比較，差異有義（P＜0.05）；24h 與 72h 相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 72h 相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

CoCl2處理濃度（umol/L)圖 1-2 CoCl2對 MM 細胞增殖活性的影響(*P<0.05,**P<0.01igure1-2：The effect of hypoxia induced by CoCl2at different concentration oof human MM cells in groups and times.2 SB-431542 對黑色素瘤 A375 細胞增殖的影響各組 SB-431542 干預 MM 細胞形態(tài)無變異。在不同的時間的吸光光度值，結果見圖 2-1。單因素方差分析顯示，方差為 0.169＞0.05，說明方差是齊性的。F 值為 11.001，P<0.05學意義。組間兩兩進一步分析顯示，24h 與 48h 相比較，差義（P＜0.05）；24h 與 72h 相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 72h 相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

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