發(fā)布時(shí)間：2020-07-22 04:45

【摘要】：研究背景銀屑病是一種常見的免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病,其病理特征為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生,細(xì)胞分裂周期及表皮細(xì)胞更替時(shí)間縮短,臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑性損害為主,病程長,反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本病發(fā)生與遺傳、環(huán)境、免疫、感染、心理因素等多種因素相關(guān),發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前暫無治愈的方法。因此探究銀屑病的發(fā)病機(jī)制是國內(nèi)外皮膚病專家研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近來研究認(rèn)為銀屑病的發(fā)生是在遺傳因素的基礎(chǔ)上,感染、精神創(chuàng)傷、外傷等各種因素誘導(dǎo)機(jī)體多種免疫細(xì)胞的調(diào)控失常,導(dǎo)致炎癥性細(xì)胞因子的釋放,進(jìn)而使機(jī)體的先天性與獲得性免疫功能發(fā)生障礙,而致相關(guān)炎癥細(xì)胞浸潤,最終發(fā)生銀屑病的特征性病理改變:角質(zhì)形成細(xì)胞的增生和異常分化,免疫炎癥細(xì)胞移入表、真皮。但是目前導(dǎo)致表皮缺陷和免疫功能障礙的潛在機(jī)制未有探明。隨著國內(nèi)外學(xué)者在小分子領(lǐng)域研究的不斷深入,在皮膚的生理病理過程中發(fā)現(xiàn)多種microRNA(miRNA)起著極其重要的調(diào)控作用,某些皮膚病如皮膚腫瘤、特應(yīng)性皮炎及銀屑病的皮損中發(fā)現(xiàn)了特異表達(dá)的miRNA。通過高通量測序、定量聚合酶鏈反應(yīng)及橋梁同位素標(biāo)記等技術(shù),許多與銀屑病相關(guān)的miRNA被篩選和驗(yàn)證。雖然研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、干擾免疫細(xì)胞的形成等作用在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用,但是目前大多數(shù)研究針對miRNA表達(dá)水平的檢測,對其調(diào)控機(jī)制大多未明,尚需大量數(shù)據(jù)支持,建立基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,探尋與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)的miRNAs,為本病診治及預(yù)防提供新靶點(diǎn)及依據(jù)。研究目的通過miRCURY LNATM microRNA Array基因芯片技術(shù)篩選銀屑病患者皮損表皮與正常對照者表皮組織中差異表達(dá)的miRNAs;運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法探究在銀屑病皮損表皮中明顯下調(diào)的miR-320b在誘導(dǎo)原代角質(zhì)形成細(xì)胞(normal human epidermal keratinocytes,NHEKs)增殖中的作用機(jī)制。第一部分銀屑病皮損表皮中異常表達(dá)microRNAs的篩選及驗(yàn)證研究方法1.收集10例銀屑病患者皮損及10例健康對照者皮膚組織,經(jīng)福爾馬林固定后石蠟包埋。選擇性別、年齡及取材部位相匹配的8例樣本(銀屑病患者與健康對照者各4例)TRIzol法從石蠟組織中提取RNA。2.采用 miRCURY LNATM microRNA Array(v.18.0)(Exiqon)基因芯片技術(shù)對銀屑病患者皮損表皮與健康對照者表皮提取的RNA進(jìn)行miRNAs的表達(dá)譜系差異分析。使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片,GenePix Pro 6.0讀取探針信號值,取得的原始值進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化。使用Fold change和P-value篩選兩組樣品間差異表達(dá)miRNAs。3.挑選6個(gè)明顯差異表達(dá)的miRNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測驗(yàn)證miRNA微陣列結(jié)果。以U6作為內(nèi)參,使用2-△△CT法計(jì)算miRNA的相對表達(dá)水平。4.另外選取12例樣本(銀屑病患者及健康對照者各6例)石蠟組織,提取RNA,RT-qPCR檢測差異表達(dá)明顯的miR-320b、miR-1246的表達(dá)水平,以U6作為內(nèi)參,使用2-△△C△法分析計(jì)算數(shù)據(jù),進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果1.通過miRCURY LNATM microRNA Array基因芯片技術(shù)檢測和分析8例樣本(銀屑病患者皮損和健康對照者皮膚各4例)表皮組織中差異性表達(dá)的miRNAs,對芯片結(jié)果進(jìn)行分析,兩組樣本間差異表達(dá)的miRNA共有243個(gè);其中Fold Change,(FC)≥1.5,P-value≤0.05表達(dá)差異miRNA共116個(gè),表達(dá)上調(diào)的45個(gè)(占35.7%,表達(dá)下調(diào)的71個(gè)(占56.3%)。2.RT-qPCR檢測6個(gè)明顯差異表達(dá)miRNA的表達(dá)水平,與對照組相比,miR-1246,let-7d-3p,均表達(dá)上調(diào)(P0.05,P0.01);miR-30d-5p,let-7g-5p,miR-320b均表達(dá)下調(diào)(P0.05,P0.01),與基因芯片結(jié)果一致。miR-4475的表達(dá)水平兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.RT-qPCR檢測另外12例樣本(銀屑病患者皮損和健康者皮膚各6例)表皮組織中miR-1246及miR-320b的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與健康對照組相比miR-1246表達(dá)上調(diào)1.98倍(P0.01),miR-320b表達(dá)下調(diào)0.26倍(P0.01)。第二部分microRNA-320b在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及對其增殖的影響研究方法1.體外培養(yǎng)NHEKs,經(jīng)2-3次傳代獲得純化的NHEKs,選擇第3代NHEKs予驗(yàn)證后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞沉淀中提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)DNA。U6用作參照基因使樣品標(biāo)準(zhǔn)化,行RT-PCR檢測,2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。3.構(gòu)建低表達(dá)的miR-320b慢病毒載體,轉(zhuǎn)染至NHEKs中,下調(diào)細(xì)胞中miR-320b的表達(dá)水平,同時(shí)設(shè)立慢病毒陰性對照組。4.NHEKs轉(zhuǎn)染1、2、3、4天,3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide,MTT)檢測體外細(xì)胞增殖活力。5.NHEKs 轉(zhuǎn)染 1、2、3、4 天,溴脫氧尿苷染色(Bromodeoxyuridine,Brdu)進(jìn)一步檢測體外細(xì)胞增殖活力。結(jié)果1.使用U6作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參,RT-PCR檢測NHEK中miR-320b呈高表達(dá)。2.MTT檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染第4天,與正常對照組(NC)相比,miR-320b低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組(Down)細(xì)胞增殖活力水平顯著升高(P0.001)。3.Brdu檢測顯示,轉(zhuǎn)染第4天,miR-320b低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組(Down)細(xì)胞增殖活力水平較正常對照組(NC)顯著升高(P0.05)。第三部分 microRNA-320b 調(diào)控 STAT3/SAPK/JNK 對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用研究方法1.應(yīng)用生物信息數(shù)據(jù)庫Miranda及Targetscan2種microRNA 靶基因預(yù)測軟件對miR-320b進(jìn)行靶基因預(yù)測。2.通過在線軟件(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-320b與 AKT3 的結(jié)合位點(diǎn),將AKT3的miR-320b結(jié)合位點(diǎn)突變(pMIR-REPORT Luciferase-AKT3-3'UTR(MT))和野生型(pMIR-REPORT Luciferase-AKT3-3'UTR(WT))序列插入到報(bào)告質(zhì)粒中。分別將野生型或突變型雙報(bào)告載體與miR-320b mimics及陰性對照(mimics control)共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中,在雙熒光素酶報(bào)告檢測儀下檢測各組細(xì)胞的熒光酶活性。3.將miR-320b抑制物(miR-320b inhibitor)及陰性對照(miR-320b inhibitor control)轉(zhuǎn)染至NHEKs,48小時(shí)后蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測兩組靶基因AKT3蛋白表達(dá)水平,以GAPDH作為內(nèi)源對照,驗(yàn)證mir320b對靶基因AKT3的調(diào)控作用。4.使用 Cell Signaling Technology(CST)公司的 PathScan(?)Antibody Array Kit,檢測和比較miR-320b低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組和對照組中信號通路關(guān)鍵信號分子的變化,分析miR-320b可能調(diào)控的信號通路。結(jié)果1.利用Miranda和Targetscan 2種microRNA靶基因預(yù)測軟件分別得到5982個(gè)和1573個(gè)潛在靶基因,取兩者靶基因的交集得到553個(gè)交集靶基因,包括AKT3、PTEN、CMPK1、RUNX1等。查閱文獻(xiàn)選擇與細(xì)胞增殖相關(guān)的AKT3進(jìn)一步研究。2.雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染miR-320b mimics和pMIR-REPORT Luciferase-AKT3-3 ' UTR(WT)細(xì)胞組及 miRNA-320b mimics和pMIR-REPORTLuciferase-AKT3-3'UTR(MT)細(xì)胞組的熒光素酶活性較其他2組明顯降低(P0.0001),而在結(jié)合位點(diǎn)突變后,這種調(diào)控關(guān)系沒有明顯變化(p=0.0507)。3.Western blot檢測結(jié)果顯示:相對于正常對照組,miR-320b低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的靶基因AKT3蛋白表達(dá)水平升高。4.NHEKs慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)miRNA-320b后,pathscan檢測細(xì)胞內(nèi)信號通路中相關(guān)基因,通路中STAT3,SAPK/JNK蛋白的磷酸化水平顯著上調(diào)。結(jié)論1.與健康對照組相比,miR-3 20b在銀屑病皮損表皮組織中低表達(dá)2.下調(diào)miR-320b的表達(dá)可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖3.AKT3為miR-320b調(diào)控的靶基因4.下調(diào)miRNA-320b,STAT3/SAPK/JNK蛋白的磷酸化水平上調(diào)5.miR-320b可能通過靶向AKT3調(diào)控STAT3/SAPK/JNK磷酸化水平促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R758.63
【圖文】：

圖１＿１邋ｍｉＲＮＡ微陣列芯片檢測樣本中４例銀屑病患者皮損的組織學(xué)改變逡逑

圖１－３邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測６個(gè)明顯差異表達(dá)ｍｉＲＮＡ的表達(dá)水平逡逑與對照組相比，ｍｉＲ－１２４６，邋ｌｅｔ－７ｄ－３ｐ均呈表達(dá)上調(diào)ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ，逡逑

ｆ邋＾邐＾逡逑＞０？逡逑圖１－３邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測６個(gè)明顯差異表達(dá)ｍｉＲＮＡ的表達(dá)水平逡逑與對照組相比，ｍｉＲ－１２４６，邋ｌｅｔ－７ｄ－３ｐ均呈表達(dá)上調(diào)ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ，逡逑ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ，ｍｉＲ－３２０ｂ均呈表達(dá)下調(diào)。（ＲＴ－ＰＣＲ實(shí)時(shí)定量熒光聚逡逑合酶鏈反應(yīng)，＊，Ｐ＜0．0５，＊＊，邋Ｐ＜０．０１）逡逑３３逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2765344