【摘要】： 目的構(gòu)建尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的雙順反子表達載體，并使其在哺乳動物細胞內(nèi)表達，以期建立含有人乳頭瘤病毒6b型晚期基因的細胞模型，便于進一步研究人乳頭瘤病毒L1蛋白的分子生物學特性和對其免疫學干預及治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法表達質(zhì)粒pEGFP-HPV6bL1經(jīng)雙酶切純化后與經(jīng)過相同雙酶切的真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP連接，熱沖擊入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)擴增后酶切鑒定，挑選陽性克隆進行測序。重組質(zhì)粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染進NIH3T3細胞，熒光顯微鏡下觀察EGFP蛋白的表達，RT-PCR檢測HPV6b L1 mRNA的生成。 結(jié)果通過雙酶切及測序鑒定，重組質(zhì)粒中插入的目的基因片斷及載體DNA大小、方向和插入位點均正確，pIRES2-HPV6bL1-EGFP構(gòu)建成功。重組體成功轉(zhuǎn)染進NIH3T3細胞，并用選擇性培養(yǎng)基G418篩選。同時熒光倒置顯微鏡下可觀察到細胞內(nèi)有綠色熒光蛋白的表達。進一步進行RT-PCR，檢測到HPV6b L1 mRNA的生成。 結(jié)論攜帶HPV6b L1的重組體pIRES2-HPV6bL1-EGFP成功構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染進NIH3T3細胞。經(jīng)熒光倒置顯微鏡觀察及RT-PCR方法檢測證明HPV6b L1在NIH3T3細胞內(nèi)成功表達。該研究成果可望進一步用于研究人乳頭瘤病毒晚期基因L1蛋白的生物學特性和進行防治疫苗的基因工程研究。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R752.53
【圖文】：

第二部分材料及方法實驗材料1標叫HPV6bLl(1500bP)構(gòu)建并保存。基因開放讀碼框的重組質(zhì)粒PEGFP一HPV6bLI為(1)(2)(3)菌株:E.collDH5a菌株(由暨南大學醫(yī)學院中心實驗室保存)。質(zhì)粒:含增強型綠色熒光蛋白報告基因的真核表達載PIREsZ一EGFP(由暨南大學醫(yī)學院中心實驗室保存)。細胞:小鼠成纖維細胞(NIH3T3)(購自中山大學實驗動物中心

文人乳頭瘤病毒6bLI雙順反子載體的構(gòu)建及其在哺第三部分實驗結(jié)果的基因重組質(zhì)粒的酶切電泳}PV6bLI重組質(zhì)粒經(jīng)BanHI單酶切后，取酶切產(chǎn)泳，結(jié)果顯示(見圖4)，在紫外透射反射檢測儀上GFP一CI長度(4.7kb)和HPV6bLI長度(1.skb)(見圖3)。

培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA為模板及空載體作雙酶切。0.8%瓊脂糖電泳，紫外透射反射檢測儀上觀察可見一條1.SKb的目的片斷和4.7kb的載體片斷，與預期的結(jié)果相符(見圖5)，可以初步證實上述HPV6bLI片段已插入到表達質(zhì)粒pIRESZ一EGFp中，重組質(zhì)粒pIRESZ一HpV6bLI一EGFp構(gòu)建成功。12223bP2.0kb’、、 1.sk卜4254bPl。ok卜489bP25bP圖5重組質(zhì)粒pIREsZ一HpV6bLI一EGFp的酶切鑒定 Fig.5IdentifieationofrccombiantPlasmidPIRESZ一HPV6bLI一 EGFPbyrestrietiondigestion Ml:DNAMarkerVllMZ:人一 EeoT141digestDNAMarker l:rceombiantPlasmidPIRESZ一HPV6bLI一 EGFPdigested withBamH1andSael2:HPV6bLI2.測序鑒定將所構(gòu)建重組質(zhì)粒PIRESZ一HPV6bLI一EGFP進行酶切初步鑒定后，送上海生工生物公司對插入片段進行測序，結(jié)果顯示與原序列一致(全長15O3bp)，可以進·步證實重組質(zhì)粒Pl既52一HPV6bLI一EGFP構(gòu)建成功(見附錄1和附錄2)。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2764227