【摘要】： 目的構(gòu)建尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，并使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以期建立含有人乳頭瘤病毒6b型晚期基因的細(xì)胞模型，便于進(jìn)一步研究人乳頭瘤病毒L1蛋白的分子生物學(xué)特性和對(duì)其免疫學(xué)干預(yù)及治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HPV6bL1經(jīng)雙酶切純化后與經(jīng)過(guò)相同雙酶切的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP連接，熱沖擊入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)擴(kuò)增后酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。重組質(zhì)粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH3T3細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察EGFP蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)HPV6b L1 mRNA的生成。 結(jié)果通過(guò)雙酶切及測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒中插入的目的基因片斷及載體DNA大小、方向和插入位點(diǎn)均正確，pIRES2-HPV6bL1-EGFP構(gòu)建成功。重組體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH3T3細(xì)胞，并用選擇性培養(yǎng)基G418篩選。同時(shí)熒光倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)到HPV6b L1 mRNA的生成。 結(jié)論攜帶HPV6b L1的重組體pIRES2-HPV6bL1-EGFP成功構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH3T3細(xì)胞。經(jīng)熒光倒置顯微鏡觀察及RT-PCR方法檢測(cè)證明HPV6b L1在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。該研究成果可望進(jìn)一步用于研究人乳頭瘤病毒晚期基因L1蛋白的生物學(xué)特性和進(jìn)行防治疫苗的基因工程研究。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R752.53
【圖文】：

第二部分材料及方法實(shí)驗(yàn)材料1標(biāo)叫HPV6bLl(1500bP)構(gòu)建并保存�；蜷_(kāi)放讀碼框的重組質(zhì)粒PEGFP一HPV6bLI為(1)(2)(3)菌株:E.collDH5a菌株(由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存)。質(zhì)粒:含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)載PIREsZ一EGFP(由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存)。細(xì)胞:小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

文人乳頭瘤病毒6bLI雙順?lè)醋虞d體的構(gòu)建及其在哺第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基因重組質(zhì)粒的酶切電泳}PV6bLI重組質(zhì)粒經(jīng)BanHI單酶切后，取酶切產(chǎn)泳，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4)，在紫外透射反射檢測(cè)儀上GFP一CI長(zhǎng)度(4.7kb)和HPV6bLI長(zhǎng)度(1.skb)(見(jiàn)圖3)。

培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA為模板及空載體作雙酶切。0.8%瓊脂糖電泳，紫外透射反射檢測(cè)儀上觀察可見(jiàn)一條1.SKb的目的片斷和4.7kb的載體片斷，與預(yù)期的結(jié)果相符(見(jiàn)圖5)，可以初步證實(shí)上述HPV6bLI片段已插入到表達(dá)質(zhì)粒pIRESZ一EGFp中，重組質(zhì)粒pIRESZ一HpV6bLI一EGFp構(gòu)建成功。12223bP2.0kb’、、 1.sk卜4254bPl。ok卜489bP25bP圖5重組質(zhì)粒pIREsZ一HpV6bLI一EGFp的酶切鑒定 Fig.5IdentifieationofrccombiantPlasmidPIRESZ一HPV6bLI一 EGFPbyrestrietiondigestion Ml:DNAMarkerVllMZ:人一 EeoT141digestDNAMarker l:rceombiantPlasmidPIRESZ一HPV6bLI一 EGFPdigested withBamH1andSael2:HPV6bLI2.測(cè)序鑒定將所構(gòu)建重組質(zhì)粒PIRESZ一HPV6bLI一EGFP進(jìn)行酶切初步鑒定后，送上海生工生物公司對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示與原序列一致(全長(zhǎng)15O3bp)，可以進(jìn)·步證實(shí)重組質(zhì)粒Pl既52一HPV6bLI一EGFP構(gòu)建成功(見(jiàn)附錄1和附錄2)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2764227