【摘要】： 目的篩選在人皮膚黑素瘤中表達的已知hsa-microRNA,根據(jù)篩選結(jié)果,探討相應(yīng)的hsa-microRNA在該疾病中的功能,為闡明黑素瘤發(fā)病機制、尋求有效的治療途徑提供理論和實驗依據(jù)。 方法采用SBC microRNA芯片技術(shù),將6例人皮膚黑素瘤組織總RNA分別與9例健康人色素痣總RNA的混合物對比,篩選其中已知的468條hsa-microRNA表達情況。根據(jù)生物信息學(xué)的有關(guān)方法處理芯片實驗數(shù)據(jù),篩選出共同差異表達的候選hsa-microRNA。采用熒光實時定量PCR的方法,分別檢測這6例人皮膚黑素瘤組織中的各候選hsa-microRNA的表達情況。將芯片和qPCR兩種方法結(jié)論一致的候選hsa-microRNA確定為有意義的共同差異表達hsa-microRNA。檢測表達差異最明顯的hsa-microRNA在A375和M14細胞系中的表達情況。 采用microRNA-21 inhibitor脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染黑素瘤細胞系,設(shè)立對照組,并設(shè)立microRNA-21 inhibitor 90nmol/L、180 nmol/L、270 nmol/L三個濃度,分別用CCK-8試劑盒檢測細胞活性變化,并分析該濃度與細胞活性之間的關(guān)系。將活性變化最明顯的一組細胞系用FCM術(shù)檢測細胞周期與細胞凋亡的改變,同時用RT-PCR法檢測其中的BRAF和p27基因mRNA表達水平。 結(jié)果 1、此6例人皮膚黑素瘤中miRNA-21明顯上調(diào)表達,miRNA-320和miRNA-494明顯下調(diào)表達。 2、黑素瘤細胞系A(chǔ)375和M14中均有miRNA-21不同程度的表達。 3、將miRNA-21 inhibitor轉(zhuǎn)染A375和M14細胞,當抑制劑濃度為90nmol/L時,細胞活性受到明顯抑制;提高抑制劑濃度,A375細胞活性受到進一步抑制,且二者之間存在相關(guān)性。 4、經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor且細胞活性發(fā)生明顯抑制的A375細胞,其G1期細胞比率明顯增高,而S期細胞比率明顯降低,細胞凋亡比率增高。 5、經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor且細胞活性發(fā)生明顯抑制的A375細胞中的BRAF基因和p27基因mRNA表達水平?jīng)]有明顯變化。 結(jié)論運用miRNA芯片技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)人皮膚黑素瘤組織中miRNA-21明顯上調(diào)表達,miRNA-320和miRNA-494明顯下調(diào)表達。miRNA-21在黑素瘤細胞中抑制細胞凋亡、促進細胞增殖,可能起原癌基因樣的作用。miRNA-21對BRAF和p27基因的mRNA表達水平無明顯影響。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R739.5
【圖文】：

圖1mieroRNA的生物合成與作用機制示意圖截至2007年2月，在http:/lmicrorna.sanger.ac.ukSangermiRNA數(shù)據(jù)庫注冊miRNA多達468條，httP:/漁里叫魚匹魚巡邊組公布相應(yīng)的miRNA預(yù)測的靶mRNA，為人們開展miRNA的表達譜以及相應(yīng)功能研究奠定了基礎(chǔ)。有關(guān)NA在人類生長發(fā)育、腫瘤、病毒感染性疾病等方面的研究工作正在熱火朝

芯片點陣示意圖

標標準化后數(shù)據(jù)基因表表 差差異基因信息表 表 圖1一2數(shù)據(jù)分析流程圖

【參考文獻】

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本文編號：2764176