【摘要】：研究背景: 白癜風是一種獲得性黑素細胞(MC)破壞所致皮膚和毛發(fā)的色素脫失性疾病。它雖然對人的身體沒有大的損害,但是影響美容,進而患者產(chǎn)生心理壓力,導致嚴重的心理問題。其發(fā)病機制目前尚不清楚,國內(nèi)外大量研究表明,該病發(fā)病機制可能與遺傳、免疫、神經(jīng)精神等方面有關(guān)。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)在白癜風發(fā)生和發(fā)展過程中有很多細胞因子參與。研究證實圍繞在MC周圍的角質(zhì)形成細胞(KC)能分泌堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)及干細胞因子(SCF)。bFGF及ET-1是MC生長分化的重要因子,是MC的內(nèi)源性促分裂劑。ET-1還可通過受體介導的信號傳導途徑刺激MC增殖,黑素生成及增加酪氨酸酶(Tyr)的活性。SCF能夠刺激體外培養(yǎng)的MC增殖和促進移植表皮的存活。因此,研究這些細胞因子對于探索白癜風的發(fā)病機制及尋找白癜風治療新方法具有一定的意義。近年來臨床使用驅(qū)蟲斑鳩菊(vernoniaanthelmintica,VW)配合紫外線(UV)照射治療白癜風,取得了顯著療效,但其治療機制尚不清楚。除了直接作用于MC,使其活化、增殖,并遷移到皮損區(qū)達到復色外,推測其還可能與KC分泌的細胞因子介導的MC增殖和遷移有關(guān)。 實驗目的 觀察VW分別聯(lián)合中波紫外線(UltravioletB,UVB)及長波紫外線(Ultr-avioletA,UVA)照射對人永生化角質(zhì)細胞株(HaCaT細胞)產(chǎn)生細胞因子的影響作用;觀察VW分別聯(lián)合UVB、UVA照射通過作用HaCaT細胞后的上清液對培養(yǎng)的人黑素細胞瘤A375細胞株(A375細胞)增殖和遷移的影響。 實驗方法 1.細胞培養(yǎng):以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細胞及A375細胞,分別接種于6孔或96孔培養(yǎng)板中。 2.紫外線照射:根據(jù)實驗設計使用UVB及UVA照射培養(yǎng)的HaCaT細胞,分別于照射前24h使用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),使用VW配合UVB或UVA照射及VW的實驗組在照射前2h使用VW進行干預處理,并設陰性對照組。 3.各組上清液的收集:48小時后收集各組上清液,經(jīng)1000g離心5分鐘,分裝后-70℃保存。 4.各組上清液中細胞因子含量的測定:使用ELISA試劑盒測定細胞上清液中的bFGF、ET-1及SCF的含量。 5.A375細胞增殖實驗:各組上清液作為條件化培養(yǎng)基培養(yǎng)A375細胞,MTT法檢測各組條件化培養(yǎng)基對A375細胞增殖的影響。 6.A375細胞遷移實驗:各組上清液作為條件化培養(yǎng)基趨化A375細胞,使用Transwell小室檢測各組條件化培養(yǎng)基對A375細胞的趨化能力。 7.統(tǒng)計學分析:采用單因素方差分析,數(shù)據(jù)處理應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件,P0.05時差異有統(tǒng)計學意義。 實實驗結(jié)結(jié)果 1.VW聯(lián)聯(lián)合UVB,VW聯(lián)聯(lián)合UVA,VW,UVB及UVA對HaCaT細細細細胞胞胞分分泌bFGF、ET-1及SCF的的的影影響. VW聯(lián)合UVB及UVB組HaCaT細胞分泌bFGF的量(分別為119.430±6.828ng/L及102.839±6.826ng/L)明顯高于陰性對照組(62.982±8.250ng/L)(P0.05),此兩者間相比則沒有顯著性差異(P0.05)。表明VW聯(lián)合UVB及UVB都能促進HaCaT細胞分泌bFGF。VW聯(lián)合UVB及UVB組HaCaT細胞分泌ET-1的量(分別為4.470±0.192g/L及4.233±0.116g/L)明顯高于陰性對照組(3.820±0.212g/L)(P0.05),此兩者比較亦無顯著性差異(P0.05)。表明VW聯(lián)合UVB及UVB都能促進HaCaT細胞分泌ET-1。VW聯(lián)合UVB組HaCaT細胞分泌SCF的量(128.27±3.35ng/L)明顯高于陰性對照組(103.60±8.67ng/L)(P0.05),表明VW聯(lián)合UVB能夠促進HaCaT細胞分泌SCF。UVB組HaCaT細胞分泌SCF的量(113.64±7.39ng/L)與陰性對照組相比較,無顯著性差異,表明UVB不能促進HaCaT細胞分泌SCF。VW聯(lián)合UVA組、VW組及UVA組分泌的bFGF、ET-1及SCF的量與陰性對照組相比均無顯著性差異(P0.05),表明這些組都不能促進HaCaT細胞分泌bFGF、ET-1及SCF。 2.VW聯(lián)聯(lián)合UVB,VW聯(lián)聯(lián)合UVA,VW,UVB及UVA作作用HaCaT細細細細胞胞胞胞后后后的的上清清清液液對A375細細細細胞胞胞增增殖效效應的的的影影響VW聯(lián)合UVB組及UVB組作用HaCaT細胞后的上清液作為條件化培養(yǎng)基培養(yǎng)A375細胞48h后,吸光度A值(分別為0.582±0.0554及0.509±0.060)明顯大于陰性對照組(0.332±0.070)(P0.05),此兩者間相比沒有顯著性差異(P0.05)。表明VW聯(lián)合UVB及UVB都能通過刺激HaCaT細胞后促進A375細胞增殖。VW、VW聯(lián)合UVA及UVA作用HaCaT細胞后的上清液對A375細胞增殖效應的促進作用與陰性對照組相比均無明顯差異(P0.05),表明這些組都不能通過HaCaT細胞促進A375細胞的增殖。 3.VW聯(lián)聯(lián)合UVB,VW聯(lián)聯(lián)合UVA,VW,UVB及UVA作作用HaCaT細細細細胞胞胞胞后后后的的上清清清液液對A375細細細細胞胞胞遷遷移的的的影影響 VW聯(lián)合UVB組及UVB組作HaCaT后的細胞上清液作為條件化培養(yǎng)基趨化A375細胞,通過Transwell小室微孔濾膜的細胞個數(shù)(分別為72±6個/40倍鏡視野及60±5/40倍鏡視野)明顯多于陰性對照組(42±13個/40倍鏡視野)(P值分別為0.003及0.035),此兩者之間相比無顯著性差異(P0.05)。說明VW聯(lián)合UVB及UVB作用HaCaT細胞后的上清液能促進A375細胞的遷移。并且UVB與VW刺激HaCaT細胞后促進A375細胞遷移有協(xié)同效應。VW、VW聯(lián)合UVA及UVA作用HaCaT細胞后的上清液對A375細胞遷移的促進作用與陰性對照組相比較均無明顯差異(P0.05),表明VW、VW聯(lián)合UVA及UVA都不能通過HaCaT細胞促進A375細胞遷移。 結(jié)論 1.VW聯(lián)合UVB組及單用UVB組能夠上調(diào)HaCaT細胞分泌bFGF、ET-1,并且它們的上清液能夠促進A375細胞的增殖及遷移。這提示臨床上使用VW聯(lián)合UVB及單獨UVB治療白癜風可能通過促進KC分泌bFGF及ET-1刺激MC增殖及遷移。 2.VW聯(lián)合UVB組能顯著促上調(diào)HaCaT細胞分泌SCF,但UVB無促進HaCaT細胞分泌SCF。這可能和臨床上使用VW聯(lián)合UVB治療白癜風的療效強于單用UVB有關(guān)。 3.本次實驗中,VW聯(lián)合UVA、VW及UVA沒有明顯促進HaCaT細胞分泌bFGF、ET-1及SCF,它們的上清液也沒有促進A375細胞的增殖和遷移。這說明可能是通過其它機理來達到皮損白斑區(qū)的復色。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R758.41

【參考文獻】

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本文編號：2759550